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【求助/交流】关于his-tagged 蛋白纯化
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求助关于his-tagged 蛋白纯化（变性条件下） 怎样得到高纯度的目的蛋白 知识经验或专门文献 [ Last edited by 543608268 on 2011-1-19 at 14:02 ] |
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543608268(金币+5): 2011-01-19 13:58:27
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3楼2011-01-19 13:54:30
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7楼2011-01-21 09:36:44
关于蛋白质纯化的实验
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rainwander(金币+3): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-23 22:29:56
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这是我最近用的实验步骤，可能对你有帮助，我用的镍柱试剂盒，不知你的实验方法是什么，有机会多多交流。 Ni2+柱的分离纯化 1. 轻轻颠倒混匀固化Ni2+树脂，取2ml装入层析住，树脂自然沉降。 2. 用3倍体积的无菌水冲洗树脂。 3. 用3倍体积的结合缓冲液平衡树脂，放置待第9步使用。 4. 每100 ml细胞培养物的细菌沉淀悬于4 ml结合缓冲液（pH 7.8） 5. 加入溶菌酶至1mg/ml，冰上放置30min。 6. 混合物与4℃摇床上孵育10min。 7. 加入Triton X-100、Dnase和Rnase，终浓度分别为1％、5 ug/ml、5 ug/ml，在于4℃摇床上孵育10min。 8. 4℃ 5000r/min，离心3min, 去处不溶性细胞碎片。上清转移到一新管中。 9. 树脂上的结合缓冲液引流到柱顶部。 10. 步骤8获得的细胞裂解液上清上柱，流速调整为每小时10个柱体积。 11. 用6个柱体积的结合缓冲液（ph 7.8 ）洗柱。 12. 用4个柱体积的洗涤缓冲液（ph 6.0）洗柱，直至流过液A280<0.01。 13. 用6个柱体积的10mmol/L咪唑洗脱缓冲液洗脱结合的蛋白，每份1 ml分布收集，检测A280。 14. 用咪唑浓度更高的洗脱缓冲液重复步骤13。 15. 用20 ul 等分的蛋白进行10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析聚组氨酸标签蛋白的分布。 |
8楼2011-01-23 21:20:25
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