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543608268

金虫 (正式写手)

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[交流] 【求助/交流】关于his-tagged 蛋白纯化

求助关于his-tagged 蛋白纯化（变性条件下）怎样得到高纯度的目的蛋白知识经验或专门文献

[ Last edited by 543608268 on 2011-1-19 at 14:02 ]

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1楼 2011-01-19 13:46:18

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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

543608268(金币+5): 2011-01-19 13:58:48

上样平衡后先用低浓度咪唑预洗脱，除去亲和力小的杂蛋白，然后高浓度咪唑洗脱下目标蛋白。

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2楼2011-01-19 13:49:42

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henkally

禁虫 (著名写手)

543608268(金币+5): 2011-01-19 13:58:27

本帖内容被屏蔽

3楼2011-01-19 13:54:30

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xhjggl

木虫 (正式写手)

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543608268(金币+5): 2011-01-21 00:58:49

可以到上海生工网站上下载说明书啊！

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4楼2011-01-20 15:16:44

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JASON13

银虫 (小有名气)

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楼上注意，人家说是变性条件下

可以用6M的盐酸胍，ph7.8破菌
8m尿素，磷酸bf，ph7.8 binding
8m尿素，磷酸bf，ph6 washding
8m尿素，磷酸bf，<4 elution

详细可找镍柱的说明书，可定能找到。。。

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5楼2011-01-20 18:27:06

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ben1147

木虫 (正式写手)

543608268(金币+5): 2011-01-21 00:58:33

引用回帖:

Originally posted by henkally at 2011-01-19 13:54:30:
对，镍柱就好。
不过从我们实验室的经验来看，光是一个HIS标签，过下镍柱，很难做到电泳纯啊~

想只通过过镍柱就得到很高纯度的重组蛋白是不现实的，毕竟组氨酸也是正常蛋白质的组成成分，吸附、洗脱无非就是一个重组蛋白的His-tag和杂蛋白里的his残基竞争Ni2+的过程，从原理上就决定了这并不是一个高特异性的纯化方法，尤其是在重组蛋白诱导表达量并不高、与杂蛋白相比并不占绝对优势的情况下。

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6楼2011-01-20 19:55:09

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henkally

禁虫 (著名写手)

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流

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7楼2011-01-21 09:36:44

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zeqyanyan

金虫 (小有名气)

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关于蛋白质纯化的实验

★ ★ ★ ★
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rainwander(金币+3): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-23 22:29:56

这是我最近用的实验步骤，可能对你有帮助，我用的镍柱试剂盒，不知你的实验方法是什么，有机会多多交流。
Ni2+柱的分离纯化
1. 轻轻颠倒混匀固化Ni2+树脂，取2ml装入层析住，树脂自然沉降。
2. 用3倍体积的无菌水冲洗树脂。
3. 用3倍体积的结合缓冲液平衡树脂，放置待第9步使用。
4. 每100 ml细胞培养物的细菌沉淀悬于4 ml结合缓冲液（pH 7.8）
5. 加入溶菌酶至1mg/ml，冰上放置30min。
6. 混合物与4℃摇床上孵育10min。
7. 加入Triton X-100、Dnase和Rnase，终浓度分别为1％、5 ug/ml、5 ug/ml，在于4℃摇床上孵育10min。
8. 4℃ 5000r/min，离心3min, 去处不溶性细胞碎片。上清转移到一新管中。
9. 树脂上的结合缓冲液引流到柱顶部。
10. 步骤8获得的细胞裂解液上清上柱，流速调整为每小时10个柱体积。
11. 用6个柱体积的结合缓冲液（ph 7.8 ）洗柱。
12. 用4个柱体积的洗涤缓冲液（ph 6.0）洗柱，直至流过液A280<0.01。
13. 用6个柱体积的10mmol/L咪唑洗脱缓冲液洗脱结合的蛋白，每份1 ml分布收集，检测A280。
14. 用咪唑浓度更高的洗脱缓冲液重复步骤13。
15. 用20 ul 等分的蛋白进行10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析聚组氨酸标签蛋白的分布。

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8楼2011-01-23 21:20:25

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