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543608268

金虫 (正式写手)

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[交流] 【求助/交流】关于his-tagged 蛋白纯化

求助关于his-tagged 蛋白纯化（变性条件下）怎样得到高纯度的目的蛋白知识经验或专门文献

[ Last edited by 543608268 on 2011-1-19 at 14:02 ]

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1楼 2011-01-19 13:46:18

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zeqyanyan

金虫 (小有名气)

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关于蛋白质纯化的实验

★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
rainwander(金币+3): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-23 22:29:56

这是我最近用的实验步骤，可能对你有帮助，我用的镍柱试剂盒，不知你的实验方法是什么，有机会多多交流。
Ni2+柱的分离纯化
1. 轻轻颠倒混匀固化Ni2+树脂，取2ml装入层析住，树脂自然沉降。
2. 用3倍体积的无菌水冲洗树脂。
3. 用3倍体积的结合缓冲液平衡树脂，放置待第9步使用。
4. 每100 ml细胞培养物的细菌沉淀悬于4 ml结合缓冲液（pH 7.8）
5. 加入溶菌酶至1mg/ml，冰上放置30min。
6. 混合物与4℃摇床上孵育10min。
7. 加入Triton X-100、Dnase和Rnase，终浓度分别为1％、5 ug/ml、5 ug/ml，在于4℃摇床上孵育10min。
8. 4℃ 5000r/min，离心3min, 去处不溶性细胞碎片。上清转移到一新管中。
9. 树脂上的结合缓冲液引流到柱顶部。
10. 步骤8获得的细胞裂解液上清上柱，流速调整为每小时10个柱体积。
11. 用6个柱体积的结合缓冲液（ph 7.8 ）洗柱。
12. 用4个柱体积的洗涤缓冲液（ph 6.0）洗柱，直至流过液A280<0.01。
13. 用6个柱体积的10mmol/L咪唑洗脱缓冲液洗脱结合的蛋白，每份1 ml分布收集，检测A280。
14. 用咪唑浓度更高的洗脱缓冲液重复步骤13。
15. 用20 ul 等分的蛋白进行10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析聚组氨酸标签蛋白的分布。