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傅吟雪

木虫 (小有名气)

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[交流] 【求助】植物蛋白质提取纯化方法已有8人参与

籽粒苋蛋白质的提取纯化的最佳方法，如能提供操作参考参数，那就太感谢了

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communication！

1楼 2010-06-05 22:54:34

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静水841012

铜虫 (小有名气)

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专业: 植物生理与生化

★
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也是别人的方法，不知道对你是否适用：

对于自己需要提取的蛋白离子强度，pH值不同又有不同，望注意。

植物蛋白质提取方法总汇
　　一、植物组织蛋白质提取方法

　　1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。
　　
　　2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4小时）。
　　
　　3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃
　　
　　4、提取上清液，样品制备完成。
　　
　　蛋白质提取液：300ml
　　
　　1、1mtris-hcl（ph8） 45ml
　　
　　2、甘油（glycerol）75ml
　　
　　3、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpolypyrrordone）6g
　　
　　这种方法针对sds-page，垂直板电泳！
　　
　　二、植物组织蛋白质提取方法
　　
　　氯醋酸—丙酮沉淀法
　　
　　1、在液氮中研磨叶片
　　
　　2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。
　　
　　3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。
　　
　　4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。
　　
　　5、用brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。
　　
　　药品：提取液：含10%tca和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮。裂解液：2.7g尿素0.2gchaps溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1m的dtt65ul/ml。
　　
　　这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！
　　
　　三、组织：肠黏膜
　　
　　目的：western blot检测凋亡相关蛋白的表达
　　
　　应用tripure提取蛋白质步骤：
　　
　　含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mltripure用量）
　　
　　倒转混匀，置室温10min
　　
　　离心：12000 g，10min，4度，弃上清
　　
　　加入0.3m盐酸胍/95％乙醇：（2ml每1mltripure用量）
　　
　　振荡，置室温20min
　　
　　离心： 7500g，5 min，4度，弃上清
　　
　　重复0.3m盐酸胍/95％乙醇步2次
　　
　　沉淀中加入100％乙醇 2ml
　　
　　充分振荡混匀，置室温20 min
　　
　　离心： 7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀
　　
　　1％sds溶解沉淀
　　
　　离心：10000g，10min，4度
　　
　　取上清-20度保存（或可直接用于western blot）
　　
　　存在的问题：加入1％sds后沉淀不溶解，还是很大的一块，4度离心后又多了白色沉定，sds结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。
　　
　　解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2x buffer，然后煮5－10分钟，效果很好的。
　　
　　四、植物材料：水稻苗，叶鞘，根
　　
　　1、200毫克样品置于冰上磨碎
　　
　　2、加lysis buffer，离心，10000rpm，4度，5min取上清
　　
　　3、重复离心5min
　　
　　lysis buffer：urea np-40 ampholine 2-me pvp-40
　　
　　五、蛋白质样品制备
　　
　　秧苗蛋白质样品的提取按davermal等（1986）的方法进行。
　　
　　100mg材料剪碎后加入10mgpvp-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配制，含10mm即0.07%β-巯基乙醇），混匀，-20℃沉淀1小时，4℃，15000 r/min离心15 min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10 mmβ-巯基乙醇)，再于-20℃沉淀1小时，同上离心弃上清，（有必要再用80％丙酮(含10 mmβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。
　　
　　按每mg干粉加入20μl（可调） uks液[9.5 m尿素，5mm碳酸钾，1.25%sds，0.5%dtt(二硫苏糖醇)，2% ampholine (amersham pharmacia biotech inc，ph3.5-10)，6% triton x-100]，37℃温育30min，期间搅动几次，28度（温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰）16000 r/min离心15 min，离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。或者-70度保存
　　
　　六、植物根中蛋白质的抽取
　　
　　(1) sample, 液氮研磨
　　
　　(2) 装1.5 ml centrifuge 用tube
　　
　　(3) 加 1m kh2po4 k2hpo4 700 ul
　　
　　(4) 12000 rpm, 4度, 10-15minite
　　
　　(5) 取上层液，蛋白质就在里面