应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【专题】蛋白新纯化思路探讨
81/1返回列表
查看: 2431  |  回复: 26
查看全部回帖 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

cgt713

银虫 (小有名气)

[交流] 【专题】蛋白新纯化思路探讨 已有14人参与

蛋白新纯化思路探讨

思路：得到需要纯化的样品中所有杂蛋白的抗体，将这些抗体结合到NHS-活化的Sepharose Fast Flow上，然后再将需要纯化的样品过这个柱子，所有杂蛋白都结合在柱子上，目的蛋白穿透出来。

具体例子：原核表达蛋白纯化
1.        无目的基因的PET28a-BL21，菌体超声破碎后离心分上清和沉淀，将上清拿去免疫兔子，得到针对杂蛋白的抗体，将抗体结合到NHS-活化的Sepharose Fast Flow上，命名这根柱子为X。PET28a-目的蛋白1-BL21诱导表达后，菌体超声破碎后离心分上清和沉淀，将上清过X柱，所有杂蛋白跟相应抗体结合，目的蛋白1穿透出来，实现纯化。
2.        无目的基因的PET28a-BL21，菌体超声破碎后离心分上清和沉淀，将沉淀拿去免疫兔子，得到针对杂蛋白的抗体，将抗体结合到NHS-活化的Sepharose Fast Flow上，命名这根柱子为Y。PET28a-目的蛋白2-BL21诱导表达后，菌体超声破碎后离心分上清和沉淀，沉淀用尿素溶解，复性后过Y柱，所有杂蛋白跟相应抗体结合，目的蛋白2穿透出来，实现纯化。
问题肯定会有很多，我们课题组想尝试这样做一些，请大家给点建议，有哪些需要注意的地方，谢谢。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2010-09-15 15:43:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cgt713

银虫 (小有名气)

谢谢

引用回帖:
Originally posted by 月月大可 at 2010-09-15 15:53:57:
三个字：不现实！

1、杂蛋白的量要远远大于目的蛋白的量，而一定体积填料的载量是有限的，超过载量了杂蛋白就跟着目的蛋白一起出来。

2、上清中很有可能有很多量比较低的蛋白，这些蛋白拿来做抗体不见得能实 ...

第一点我并不担心 可以通过控制上样量等来调整
第二点 我确实担心
赞一下 回复此楼
3楼2010-09-15 16:07:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cgt713

银虫 (小有名气)

谢谢

引用回帖:
Originally posted by dianaofyezi at 2010-09-15 19:03:15:
其实我觉得二楼说的很有道理。至于你所想的是否能够成为现实我不加评价，只能说你们有钱倒是可以玩玩！
从理论上来说菌体蛋白由很多种类，在偶联到纯化的过程中会出现不同程度的竞争或者有些蛋白就是偶联效率比较 ...

谢谢你的意见 真的很不错 我也有想到这些 只是我现在想的是怎么尽量去提高效率
赞一下 回复此楼
6楼2010-09-16 14:06:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cgt713

银虫 (小有名气)

谢谢

引用回帖:
Originally posted by 月月大可 at 2010-09-16 10:10:35:



我看来第一点才是最关键的！！！

我们平常表达的蛋白总量相对于菌体总蛋白的含量甚至1%都不到，按照你的理论我们就需要将大于99%的杂蛋白挂在柱子上，1%的目的蛋白穿透！

这样来说我需要100mg的目的蛋 ...

首先 我谢谢你的热心帮助 谢谢
但是目的蛋白的表达量只有1%，这是很难想象的 我们课题组一般平均下来都40%左右
赞一下 回复此楼
7楼2010-09-16 14:07:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cgt713

银虫 (小有名气)

谢谢

引用回帖:
Originally posted by 月月大可 at 2010-09-16 16:29:27:
我说的1%一点都不算夸张，我身边的人全在做蛋白。以他们纯化的蛋白来看如果单次培养8L菌，纯度在95%目的蛋白能收获20-30mg就算是很不错了，能获得几百毫克的那是极少见（只针对可溶性上清，包涵体对我们的实验没有 ...

嗯 谢谢你的热心帮助
赞一下 回复此楼
13楼2010-09-16 17:38:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cgt713

银虫 (小有名气)

谢谢

引用回帖:
Originally posted by lzh860801 at 2010-09-19 17:50:11:
个人认为是不现实的：原因很简单，免疫兔子你得到的抗体是多抗的，并不能保证你后续试验中需要纯化的蛋白质不会被挂上去，另外，空载体的BL21细胞和表达基因的BL21细胞中的杂蛋白一定是一样么？我觉得不一定，甚至 ...

谢谢你的宝贵建议
赞一下 回复此楼
24楼2010-09-24 08:16:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cgt713

银虫 (小有名气)
25楼2010-09-26 08:37:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 cgt713 的主题更新
81/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭