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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【专题】蛋白新纯化思路探讨
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魑魅-魍魉

新虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
是不是蛋白表达都不容易？不知各位可有pET-32a的图谱，小弟想要，另外，表达动物蛋白各位都有什么经验呢？介绍介绍呗
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风中摇曳的颤枝，何处是归根？
21楼2010-09-19 08:33:26
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lzh860801

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
个人认为是不现实的：原因很简单，免疫兔子你得到的抗体是多抗的，并不能保证你后续试验中需要纯化的蛋白质不会被挂上去，另外，空载体的BL21细胞和表达基因的BL21细胞中的杂蛋白一定是一样么？我觉得不一定，甚至可以说肯定不一样，你表达2个不同的蛋白，那么在这2个不同的表达细胞中所产生的杂蛋白肯定也是不一样的。所以觉得这种方式去纯化是不现实的。
关于第2种方式纯化包涵体蛋白，我只想说，多此一举。在纯化之前还要去中复性，又必要么，你复性的程度对纯化影响有多大很难说，直接用标签去挂不就好了
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22楼2010-09-19 17:50:11
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zwc5050

木虫 (小有名气)

一个建议

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
有几年不做纯化了，但可以提个建议，想提高纯化效率可以在构建的时候就加入HIS标签，表达后用镍柱纯化，当然如果HIS标签对你的表达产物有影响最后是需要用酶切掉的，如果没影响就更好了。
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23楼2010-09-20 10:17:40
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cgt713

银虫 (小有名气)

谢谢

引用回帖:
Originally posted by lzh860801 at 2010-09-19 17:50:11:
个人认为是不现实的：原因很简单，免疫兔子你得到的抗体是多抗的，并不能保证你后续试验中需要纯化的蛋白质不会被挂上去，另外，空载体的BL21细胞和表达基因的BL21细胞中的杂蛋白一定是一样么？我觉得不一定，甚至 ...

谢谢你的宝贵建议
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24楼2010-09-24 08:16:15
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cgt713

银虫 (小有名气)
25楼2010-09-26 08:37:05
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qqm8445

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
送鲜花一朵
引用回帖:
324891楼: Originally posted by 月月大可 at 2010-09-16 16:29:27:
我说的1%一点都不算夸张，我身边的人全在做蛋白。以他们纯化的蛋白来看如果单次培养8L菌，纯度在95%目的蛋白能收获20-30mg就算是很不错了，能获得几百毫克的那是极少见（只针对可溶性上清，包涵体对我们的实验没有 ...

哇，你们的都是可溶性表达？用什么载体呀？诱导的条件是什么呢？能指导下不？我们实验室里的基本上是包含体，真的像你说的进了一条死路。现在我想弄可溶表达的，可是效果总是不好。现在我们的载体有PRSETa ,PET 32a,PGEX 4T-1,18度过夜，25度5小时，IPTG 0.6mM,可是可溶的好少好少呀，愁呀。1L能有50mg，我们做包含体，产量也没有那么高呀。
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26楼2012-05-20 15:24:33
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月月大可

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
2398197楼: Originally posted by qqm8445 at 2012-05-20 15:24:33:
哇，你们的都是可溶性表达？用什么载体呀？诱导的条件是什么呢？能指导下不？我们实验室里的基本上是包含体，真的像你说的进了一条死路。现在我想弄可溶表达的，可是效果总是不好。现在我们的载体有PRSETa ,PET  ...

更换载体 菌株 优化表达条件在我内心基本没用（仅仅我个人感觉）。
如果有底物，并且稳定不被大肠杆菌消化利用，能被大肠杆菌吸收，可以考虑在底物或者底物类似物加入培养基中，在蛋白表达的过程中让他们亲密接触，这样可能帮助蛋白正确折叠。
如果没有这样的东西，考虑换表达体系吧。我的概念中包涵体复性成功可能性不大，并且即使得到可溶也不见得是正确折叠，一定要建立起可溶≠正确折叠的概念。
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27楼2012-05-21 06:31:19
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