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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 组氨酸标签重组蛋白纯化
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liufeifeia

铜虫 (初入文坛)

[求助] 组氨酸标签重组蛋白纯化

用GE的1ml  HisTrap HP 纯化的，binding buffer （pH7.0  25mM Tris-HCl 0.5MNaCl) 结合后，用250mM咪唑10CV线性洗脱，得到3个洗脱峰，洗脱峰1和2有交集，洗脱峰3单独的一个峰，然后超滤离心管稍微浓缩了一下跑SDS-PAGE。
1、按理说峰3应该是我的目的蛋白，可是检测酶活性峰2活性很高，峰3很微弱的活性，这是怎么回事？我哪里出错了吗？
2、后来不知道是不是柱子结合效率低了，怎么都跑不出第三个峰，检测只有穿透峰有酶活，洗脱峰没有酶活。
请各位大侠指教.....

lane1：marker  lane2：破碎液  lane3：穿透峰  lane4：洗脱峰1  lane5：洗脱峰2  lane6：洗峰脱3
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1楼 2012-02-27 10:43:57
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wen1023tao

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
过柱后用低浓度的咪唑（10mM）清洗一下，再洗脱，可能蛋白会更纯些，我是用没加咪唑的Binding，然后用低浓度的清洗杂蛋白，最后用高浓度咪唑洗脱，得到的蛋白比较纯，SDS-PAGE只跑出来只有一条带
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2楼2012-02-27 13:19:26
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zxc6884

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
直接用250mM洗杂带肯定很多啦，可以试下先后分别用10mM,50mM,100mM,200mM,300mM,500mM咪唑洗脱，也可以用线性0~500mM咪唑洗脱，分部收集。
可能洗脱峰2中的那条粗带是你的活性目的蛋白。预测下目的蛋白的大小，你是用什么系统表达的？
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3楼2012-02-27 20:24:30
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的蛋白傍柱效果很好的。穿透液都没有明显的目的蛋白。洗峰脱3理论上你的目的蛋白，我做的活性方面不多，所以不好说。在ELUTE之前，你可以用10---20mM咪唑先冲洗再拉线型，效果会好点。buffer中可以再加5%的甘油试试。
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4楼2012-03-02 11:30:51
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liufeifeia

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by zxc6884 at 2012-02-27 20:24:30:
直接用250mM洗杂带肯定很多啦，可以试下先后分别用10mM,50mM,100mM,200mM,300mM,500mM咪唑洗脱，也可以用线性0~500mM咪唑洗脱，分部收集。
可能洗脱峰2中的那条粗带是你的活性目的蛋白。预测下目的蛋白的大小，你 ...

pet28a(+)载体 利用载体上N端的6个HIS  目的蛋白大概33KDa  应该下面那一个条带的啊
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5楼2012-03-06 15:57:04
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liufeifeia

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by dshlove at 2012-03-02 11:30:51:
你的蛋白傍柱效果很好的。穿透液都没有明显的目的蛋白。洗峰脱3理论上你的目的蛋白，我做的活性方面不多，所以不好说。在ELUTE之前，你可以用10---20mM咪唑先冲洗再拉线型，效果会好点。buffer中可以再加5%的甘油 ...

5%甘油的目的是什么呢？
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6楼2012-03-06 16:06:59
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dshlove

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by liufeifeia at 2012-03-06 16:06:59:
5%甘油的目的是什么呢？

防止蛋白间的疏水作用
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7楼2012-03-06 23:17:01
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huijhruby

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by dshlove at 2012-03-02 11:30:51
你的蛋白傍柱效果很好的。穿透液都没有明显的目的蛋白。洗峰脱3理论上你的目的蛋白，我做的活性方面不多，所以不好说。在ELUTE之前，你可以用10---20mM咪唑先冲洗再拉线型，效果会好点。buffer中可以再加5%的甘油试 ...

buffer中可以再加5%的甘油试试。
这里的Buffer是指溶解蛋白的Buffer呢还是咪唑洗脱液中需要加甘油呢？？？
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8楼2013-06-05 15:32:48
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by huijhruby at 2013-06-05 15:32:48
buffer中可以再加5%的甘油试试。
这里的Buffer是指溶解蛋白的Buffer呢还是咪唑洗脱液中需要加甘油呢？？？...

最好从一开始破碎细胞就开始加甘油，如果你开始就加了，最后咪唑洗脱液中也要加甘油
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9楼2013-06-06 11:23:57
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huijhruby

木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by dshlove at 2013-06-06 11:23:57
最好从一开始破碎细胞就开始加甘油，如果你开始就加了，最后咪唑洗脱液中也要加甘油...

谢谢！~那么，再问下了，加甘油的作用是什么啊？呵呵。
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10楼2013-06-06 16:40:31
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