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liufeifeia

铜虫 (初入文坛)

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虫号: 1046011
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专业: 生物大分子结构与功能

[求助] 组氨酸标签重组蛋白纯化

用GE的1ml HisTrap HP 纯化的，binding buffer （pH7.0 25mM Tris-HCl 0.5MNaCl) 结合后，用250mM咪唑10CV线性洗脱，得到3个洗脱峰，洗脱峰1和2有交集，洗脱峰3单独的一个峰，然后超滤离心管稍微浓缩了一下跑SDS-PAGE。
1、按理说峰3应该是我的目的蛋白，可是检测酶活性峰2活性很高，峰3很微弱的活性，这是怎么回事？我哪里出错了吗？
2、后来不知道是不是柱子结合效率低了，怎么都跑不出第三个峰，检测只有穿透峰有酶活，洗脱峰没有酶活。
请各位大侠指教.....

lane1：marker lane2：破碎液 lane3：穿透峰 lane4：洗脱峰1 lane5：洗脱峰2 lane6：洗峰脱3

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蛋白质生物学实验经验

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1楼2012-02-27 10:43:57

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huijhruby

木虫 (正式写手)

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性别: MM
专业: 分子生物学新药开发抗肿

引用回帖:

4楼: Originally posted by dshlove at 2012-03-02 11:30:51
你的蛋白傍柱效果很好的。穿透液都没有明显的目的蛋白。洗峰脱3理论上你的目的蛋白，我做的活性方面不多，所以不好说。在ELUTE之前，你可以用10---20mM咪唑先冲洗再拉线型，效果会好点。buffer中可以再加5%的甘油试 ...

buffer中可以再加5%的甘油试试。
这里的Buffer是指溶解蛋白的Buffer呢还是咪唑洗脱液中需要加甘油呢？？？