24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
查看: 3492  |  回复: 10
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

liufeifeia

铜虫 (初入文坛)

[求助] 组氨酸标签重组蛋白纯化

用GE的1ml  HisTrap HP 纯化的,binding buffer (pH7.0  25mM Tris-HCl 0.5MNaCl) 结合后,用250mM咪唑10CV线性洗脱,得到3个洗脱峰,洗脱峰1和2有交集,洗脱峰3单独的一个峰,然后超滤离心管稍微浓缩了一下跑SDS-PAGE。
1、按理说峰3应该是我的目的蛋白,可是检测酶活性峰2活性很高,峰3很微弱的活性,这是怎么回事?我哪里出错了吗?
2、后来不知道是不是柱子结合效率低了,怎么都跑不出第三个峰,检测只有穿透峰有酶活,洗脱峰没有酶活。
请各位大侠指教.....

lane1:marker  lane2:破碎液  lane3:穿透峰  lane4:洗脱峰1  lane5:洗脱峰2  lane6:洗峰脱3
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

蛋白质生物学实验经验

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

huijhruby

木虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by dshlove at 2012-03-02 11:30:51
你的蛋白傍柱效果很好的。穿透液都没有明显的目的蛋白。洗峰脱3理论上你的目的蛋白,我做的活性方面不多,所以不好说。在ELUTE之前,你可以用10---20mM咪唑先冲洗再拉线型,效果会好点。buffer中可以再加5%的甘油试 ...

buffer中可以再加5%的甘油试试。
这里的Buffer是指溶解蛋白的Buffer呢还是咪唑洗脱液中需要加甘油呢???
8楼2013-06-05 15:32:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答

wen1023tao

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
过柱后用低浓度的咪唑(10mM)清洗一下,再洗脱,可能蛋白会更纯些,我是用没加咪唑的Binding,然后用低浓度的清洗杂蛋白,最后用高浓度咪唑洗脱,得到的蛋白比较纯,SDS-PAGE只跑出来只有一条带
2楼2012-02-27 13:19:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zxc6884

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
直接用250mM洗杂带肯定很多啦,可以试下先后分别用10mM,50mM,100mM,200mM,300mM,500mM咪唑洗脱,也可以用线性0~500mM咪唑洗脱,分部收集。
可能洗脱峰2中的那条粗带是你的活性目的蛋白。预测下目的蛋白的大小,你是用什么系统表达的?
关注我关注的
3楼2012-02-27 20:24:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你的蛋白傍柱效果很好的。穿透液都没有明显的目的蛋白。洗峰脱3理论上你的目的蛋白,我做的活性方面不多,所以不好说。在ELUTE之前,你可以用10---20mM咪唑先冲洗再拉线型,效果会好点。buffer中可以再加5%的甘油试试。
4楼2012-03-02 11:30:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[硕博家园] 有没有学校材料专业收跨调(一志愿085410) +6 momo(上岸版) 2026-04-06 9/450 2026-04-11 22:38 by wj165256
[考研] 267求调剂 +8 再忙也要吃饭啊 2026-04-09 8/400 2026-04-11 21:42 by cfdbai
[考研] 284求调剂 +11 archer.. 2026-04-09 12/600 2026-04-11 20:23 by 蓝云思雨
[考研] 工科273调剂 +6 X1999 2026-04-09 7/350 2026-04-11 10:23 by zhq0425
[考研] 266求调剂 +29 阳阳哇塞 2026-04-07 29/1450 2026-04-10 16:20 by 高维春
[考研] 336材料与化工085600求调剂 +21 水星记infp 2026-04-05 24/1200 2026-04-10 15:28 by luoyongfeng
[考研] 一志愿沪9,326生物学求相关专业调剂 +4 刘墨墨 2026-04-09 4/200 2026-04-10 12:07 by pengliang8036
[考研] 344求调剂 +7 丶风雪夜归人丶 2026-04-09 7/350 2026-04-10 12:05 by pengliang8036
[考研] 生物与医药调剂 +5 十七sa 2026-04-05 5/250 2026-04-10 08:14 by kangsm
[考研] 初试分332,一志愿报考西北工业大学, +11 故人?? 2026-04-09 11/550 2026-04-09 21:54 by JineShine
[考研] 334求调剂 +16 Riot2025 2026-04-08 17/850 2026-04-09 09:28 by wdyheheeh
[考研] 求调剂 +7 chenxrlkx 2026-04-05 9/450 2026-04-09 09:04 by wj165256
[考研] 一志愿华南师范大学0702物理学305调剂 +4 念常安 2026-04-07 6/300 2026-04-08 22:53 by bljnqdcc
[考研] 270求调剂 +3 031127 2026-04-06 4/200 2026-04-08 21:00 by 逆水乘风
[考研] 土木水利专硕276分求调剂 +6 我想上学!!6 2026-04-05 9/450 2026-04-08 17:45 by 宋小宝HQ
[考研] 0703调剂,一志愿天津大学319分 +23 haaaabcd 2026-04-05 26/1300 2026-04-08 16:19 by luoyongfeng
[考研] 312求调剂 +18 gtw1 2026-04-06 20/1000 2026-04-07 18:16 by 蓝云思雨
[考研] 304求调剂 +4 luoye0105 2026-04-05 4/200 2026-04-06 21:05 by 木子君1218
[考研] 08专硕275调剂 +5 AaAa7420 2026-04-05 5/250 2026-04-05 18:01 by jkddd
[考研] 296求调剂 +3 汪!?! 2026-04-05 5/250 2026-04-05 17:38 by 蓝云思雨
信息提示
请填处理意见