应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 组氨酸标签重组蛋白纯化
111/2返回列表12下一页
查看: 3434  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

liufeifeia

铜虫 (初入文坛)

[求助] 组氨酸标签重组蛋白纯化

用GE的1ml  HisTrap HP 纯化的，binding buffer （pH7.0  25mM Tris-HCl 0.5MNaCl) 结合后，用250mM咪唑10CV线性洗脱，得到3个洗脱峰，洗脱峰1和2有交集，洗脱峰3单独的一个峰，然后超滤离心管稍微浓缩了一下跑SDS-PAGE。
1、按理说峰3应该是我的目的蛋白，可是检测酶活性峰2活性很高，峰3很微弱的活性，这是怎么回事？我哪里出错了吗？
2、后来不知道是不是柱子结合效率低了，怎么都跑不出第三个峰，检测只有穿透峰有酶活，洗脱峰没有酶活。
请各位大侠指教.....

lane1：marker  lane2：破碎液  lane3：穿透峰  lane4：洗脱峰1  lane5：洗脱峰2  lane6：洗峰脱3
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

蛋白质生物学实验经验

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-02-27 10:43:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wen1023tao

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
过柱后用低浓度的咪唑（10mM）清洗一下，再洗脱，可能蛋白会更纯些，我是用没加咪唑的Binding，然后用低浓度的清洗杂蛋白，最后用高浓度咪唑洗脱，得到的蛋白比较纯，SDS-PAGE只跑出来只有一条带
赞一下 回复此楼
2楼2012-02-27 13:19:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zxc6884

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
直接用250mM洗杂带肯定很多啦，可以试下先后分别用10mM,50mM,100mM,200mM,300mM,500mM咪唑洗脱，也可以用线性0~500mM咪唑洗脱，分部收集。
可能洗脱峰2中的那条粗带是你的活性目的蛋白。预测下目的蛋白的大小，你是用什么系统表达的？
赞一下 回复此楼
关注我关注的
3楼2012-02-27 20:24:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的蛋白傍柱效果很好的。穿透液都没有明显的目的蛋白。洗峰脱3理论上你的目的蛋白，我做的活性方面不多，所以不好说。在ELUTE之前，你可以用10---20mM咪唑先冲洗再拉线型，效果会好点。buffer中可以再加5%的甘油试试。
赞一下 回复此楼
4楼2012-03-02 11:30:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liufeifeia

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by zxc6884 at 2012-02-27 20:24:30:
直接用250mM洗杂带肯定很多啦，可以试下先后分别用10mM,50mM,100mM,200mM,300mM,500mM咪唑洗脱，也可以用线性0~500mM咪唑洗脱，分部收集。
可能洗脱峰2中的那条粗带是你的活性目的蛋白。预测下目的蛋白的大小，你 ...

pet28a(+)载体 利用载体上N端的6个HIS  目的蛋白大概33KDa  应该下面那一个条带的啊
赞一下 回复此楼
5楼2012-03-06 15:57:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liufeifeia

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by dshlove at 2012-03-02 11:30:51:
你的蛋白傍柱效果很好的。穿透液都没有明显的目的蛋白。洗峰脱3理论上你的目的蛋白，我做的活性方面不多，所以不好说。在ELUTE之前，你可以用10---20mM咪唑先冲洗再拉线型，效果会好点。buffer中可以再加5%的甘油 ...

5%甘油的目的是什么呢？
赞一下 回复此楼
6楼2012-03-06 16:06:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dshlove

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by liufeifeia at 2012-03-06 16:06:59:
5%甘油的目的是什么呢？

防止蛋白间的疏水作用
赞一下 回复此楼
7楼2012-03-06 23:17:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

huijhruby

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by dshlove at 2012-03-02 11:30:51
你的蛋白傍柱效果很好的。穿透液都没有明显的目的蛋白。洗峰脱3理论上你的目的蛋白，我做的活性方面不多，所以不好说。在ELUTE之前，你可以用10---20mM咪唑先冲洗再拉线型，效果会好点。buffer中可以再加5%的甘油试 ...

buffer中可以再加5%的甘油试试。
这里的Buffer是指溶解蛋白的Buffer呢还是咪唑洗脱液中需要加甘油呢？？？
赞一下 回复此楼
8楼2013-06-05 15:32:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by huijhruby at 2013-06-05 15:32:48
buffer中可以再加5%的甘油试试。
这里的Buffer是指溶解蛋白的Buffer呢还是咪唑洗脱液中需要加甘油呢？？？...

最好从一开始破碎细胞就开始加甘油，如果你开始就加了，最后咪唑洗脱液中也要加甘油
赞一下 回复此楼
9楼2013-06-06 11:23:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

huijhruby

木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by dshlove at 2013-06-06 11:23:57
最好从一开始破碎细胞就开始加甘油，如果你开始就加了，最后咪唑洗脱液中也要加甘油...

谢谢！~那么，再问下了，加甘油的作用是什么啊？呵呵。
赞一下 回复此楼
10楼2013-06-06 16:40:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 liufeifeia 的主题更新
111/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 石河子大学（211、双一流）硕博研究生长期招生公告 +3 李子目 2026-03-22 3/150 2026-03-22 21:01 by 怎么释怀
[考研] 一志愿西安交通大学材料工程专业 282分求调剂 +11 枫桥ZL 2026-03-18 13/650 2026-03-22 20:26 by edmund7
[考研] 298求调剂 +6 上岸6666@ 2026-03-20 6/300 2026-03-22 20:21 by edmund7
[考研] 生物学071000 329分求调剂 +5 我爱生物生物爱� 2026-03-17 5/250 2026-03-22 16:42 by tcx007
[考研] 275求调剂 +6 shansx 2026-03-22 8/400 2026-03-22 15:27 by barlinike
[考研] 材料与化工（0856）304求 B区 调剂 +3 邱gl 2026-03-21 3/150 2026-03-21 13:47 by lature00
[考研] 083200学硕321分一志愿暨南大学求调剂 +3 innocenceF 2026-03-17 3/150 2026-03-21 02:35 by JourneyLucky
[考研] 初始318分求调剂（有工作经验） +3 1911236844 2026-03-17 3/150 2026-03-21 02:33 by JourneyLucky
[考研] 271材料工程求调剂 +8 .6lL 2026-03-18 8/400 2026-03-21 00:58 by JourneyLucky
[考研] 一志愿西南交大，求调剂 +5 材化逐梦人 2026-03-18 5/250 2026-03-21 00:26 by JourneyLucky
[考研] 22408 344分 求调剂 一志愿 华电计算机技术 +4 solanXXX 2026-03-20 4/200 2026-03-20 23:49 by alg094825
[考研] 材料专硕英一数二306 +7 z1z2z3879 2026-03-18 7/350 2026-03-20 23:48 by JourneyLucky
[考研] 一志愿南京理工大学085701资源与环境302分求调剂 +4 葵梓卫队 2026-03-18 6/300 2026-03-20 23:02 by JourneyLucky
[考研] 一志愿 南京航空航天大学大学 ，080500材料科学与工程学硕 +5 @taotao 2026-03-20 5/250 2026-03-20 20:16 by JourneyLucky
[考研] 环境工程调剂 +9 大可digkids 2026-03-16 9/450 2026-03-20 17:38 by 醉在风里
[考研] 材料学硕318求调剂 +5 February_Feb 2026-03-19 5/250 2026-03-19 23:51 by 23Postgrad
[考研] 材料考研调剂 +3 xwt。 2026-03-19 3/150 2026-03-19 11:22 by w沐阳w
[考研] 275求调剂 +4 太阳花天天开心 2026-03-16 4/200 2026-03-17 10:53 by 功夫疯狂
[论文投稿] 有没有大佬发小论文能带我个二作 +3 增锐漏人 2026-03-17 4/200 2026-03-17 09:26 by xs74101122
[考研] 考研调剂 +3 淇ya_~ 2026-03-17 5/250 2026-03-17 09:25 by Winj1e
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭