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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 组氨酸标记蛋白的纯化
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cherrysyp

新虫 (初入文坛)

[求助] 组氨酸标记蛋白的纯化

各位大侠，真心求助啊！
我现在要做表达载体的构建，发现选的载体并没有6个组氨酸的标记，那我在后面应该怎么纯化呢，或者说有什么办法可以把6×His-tag加进去吗？
真心感谢好心人给出建议，谢谢！
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1楼 2012-02-13 20:47:06
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xxtlxx

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

小丹木木(金币+5): good！辛苦了！情人节快乐！ 2012-02-14 10:38:51
小丹木木(MolEPI+1): 2012-02-14 10:39:34
没有看懂你的意图，请按以下分类对号入座：
1. 目的只是获取带his-tag的通用表达载体，目前商业化成熟的载体有很多，比如novagen的pet系列。
2. 目的是构建特殊的（不同宿主，特殊标记等等）带his-tag的表达载体，手中有类似pet22b之类的商业化质粒，可以从商业质粒上连mcs带his-tag甚至带promoter,terminator一起构建进你的目标载体。
3. 目的是构建特殊的（不同宿主，特殊标记等等）带his-tag的表达载体，手中无类似pet22b之类的商业化质粒，可以利用pcr方法在引物中带入HIS*6的碱基导入你的载体。
4. 只是要在该载体中表达带his-tag的基因，简单地在pcr扩增基因片段时候在引物中设计进6个his编码碱基，N端C端取决于你的蛋白。
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cherrysyp
2楼2012-02-14 06:33:56
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普通回帖

lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(专家考核): 情人节快乐！ 2012-02-14 10:40:17
载体并没有6His-tag的话，设计引物，其中一个引物含编码6His-tag的序列，PCR后克隆到你的载体，就让你的蛋白带6His-tag了。
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

cherrysyp
3楼2012-02-14 07:51:49
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cherrysyp

新虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by lxj341401 at 2012-02-14 07:51:49:
载体并没有6His-tag的话，设计引物，其中一个引物含编码6His-tag的序列，PCR后克隆到你的载体，就让你的蛋白带6His-tag了。

非常感谢您的回帖，可以给我个联系方式，进一步交流下吗，感谢啊。。。
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4楼2012-02-15 21:42:18
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cherrysyp

新虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by xxtlxx at 2012-02-14 06:33:56:
没有看懂你的意图，请按以下分类对号入座：
1. 目的只是获取带his-tag的通用表达载体，目前商业化成熟的载体有很多，比如novagen的pet系列。
2. 目的是构建特殊的（不同宿主，特殊标记等等）带his-tag的表达载体 ...

首先很感谢您这么辛苦的回复。是我自己没有表达清楚。。。
是这样的，我现在有商业化的表达载体，但是载体上没有his-tag标签，这样的话我就想到了后面纯化很麻烦，您的意思是不是我可以在合成引物的时候自己加上His-tag啊？那后面就可以用成熟的纯化方法了，是吗？
您可以留个联系方式吗，请教您一下。。。
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5楼2012-02-16 21:07:10
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tangwq

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+2): 鼓励应助 2012-02-17 13:43:07
PCR加组氨酸太麻烦，重新找个自带N-, 或C-，或两端都带6HIS的载体，重新酶切连接进去就好了。应该不麻烦，最多2-4天就搞定。
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6楼2012-02-16 21:51:22
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小周

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用PCR方法导入很简单。直接早引物中加上6-8个HIS就OK了。一般在C端！
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7楼2012-02-17 11:20:17
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