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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】蛋白质纯化的疑难问题
南方科技大学公共卫生及应急管理学院2025级博士研究生招生报考通知
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zxd95

至尊木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】蛋白质纯化的疑难问题已有10人参与

年前就做蛋白纯化，该蛋白使用pET-32a表达，分子量约34kDa，表达菌为Rosetta(DE3),因为宿主菌本身在35kDa左右就有表达；
使用HisTrap 1ml镍柱纯化后发现，目标蛋白和宿主菌35kDa左右蛋白均挂柱，我是使用说明书推荐的Buffer(20mM磷酸缓冲液 + 0.5M NaCl + 30、60、100、150、200、250、300、500mM咪唑，pH7.4)梯度洗脱的，发现在100和150mM咪唑下，目标蛋白和35kDa杂蛋白均洗脱。
割胶回收也做不出来，郁闷中！！！！！！！！！！
请虫友们指导！
谢谢！



[ Last edited by zxd95 on 2011-3-28 at 12:15 ]
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追梦的人
1楼2011-03-14 11:20:20
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★ ★ ★
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lstt09nk(金币+2): 感谢参与 2011-03-14 12:35:43
实验室还有其他的纯化柱子么？比如 离子交换柱。。

可以把载体上的组氨酸标签试着延长，把六个加到十个。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
2楼2011-03-14 11:23:24
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)

合伙创业版兼职版主

优秀版主
★
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还有这么巧的啊，杂蛋白也带his，大小也是34左右
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3楼2011-03-14 11:59:01
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chenshuai1238

金虫 (初入文坛)
★
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Originally posted by brightfuture01 at 2011-03-14 11:23:24:
实验室还有其他的纯化柱子么？比如 离子交换柱。。

可以把载体上的组氨酸标签试着延长，把六个加到十个。

请问大侠怎样增加载体的His标签呀？谢谢，我是新手。嘿嘿
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4楼2011-03-14 16:32:27
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
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引用回帖:
Originally posted by chenshuai1238 at 2011-03-14 16:32:27:
请问大侠怎样增加载体的His标签呀？谢谢，我是新手。嘿嘿

自己构建还比较繁琐，呵呵，可以用融合PCR来实现。

Novagen 有 pet 51b 及 52b 卖，都是10聚组氨酸。
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5楼2011-03-14 16:55:50
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流浪的波斯猫

银虫 (初入文坛)
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dhd997(金币+2): 欢迎交流 2011-03-29 08:44:34
我也遇到同样的问题了，我要纯化的蛋白是师兄构建的工程菌pET30a表达的，分子量约为44kDa,无论我怎么样优化洗脱条件，也会有两条杂带，楼主还比我好点，知道杂带蛋白是什么，我现在连我的杂带蛋白是什么还都不知道，哎。。。
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6楼2011-03-28 22:26:28
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xuyihui2001

银虫 (正式写手)

改换别的标签或换纯化步骤

★ ★ ★
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dhd997(金币+2): good 2011-03-29 16:40:36
我建议1。换成别的标签
2。先用离子交换作一次初步纯化，再做亲和纯化。
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7楼2011-03-29 12:41:18
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落满夏天

银虫 (正式写手)
★
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建议最后做亲和，可以试试别的方法，离子交换，疏水可以试试看。分子筛可能不好分，离得太近。
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星星之火，可以燎原
8楼2012-02-14 17:09:49
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ixido

木虫 (小有名气)
★
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可以先试一试在破碎液中加终浓度20mM的咪唑，然后再进行梯度洗脱，这样能减少一定的非特异吸附
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9楼2012-02-14 17:20:45
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sdxianwei

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可以试一下其他性质的分离介质，离子交换 疏水等
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小木虫
10楼2012-03-16 13:00:14
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