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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 95KD蛋白纯化求助！！！！！！！！
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若鱼@@

新虫 (初入文坛)

[求助] 95KD蛋白纯化求助！！！！！！！！

本人做了一个95KD的聚合酶蛋白，表达量蛮小，纯化过程中遇到了困难。分别用了20mM、50mM和250mM的咪唑溶液进行洗脱，发现在20和50mM低浓度洗脱时候，杂蛋白洗下来很少，250mM咪唑却把大量目的蛋白和杂蛋白一起洗脱下来了，给纯化造成了极大的困难。小弟想请教下各位大侠有什么高招给解决下。

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1楼 2012-05-22 16:54:48
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回帖置顶 ( 共有1个 )

dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
silicare: 金币+6, BioEPI+1, 应助指数+1, 有道理 2012-05-22 18:00:54
若鱼@@: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-05-23 09:09:52
建议你先用Imidazole拉个线性试试，最佳浓度能洗下杂蛋白。再用阶梯去洗。不过这只是摸条件用，这样目的蛋白损失会很大。最好的是阶梯洗脱。
对于你这张蛋白胶，不知道你洗杂的量。
我看50mM时候你的目的蛋白就已经开始下来了，而后面你直接跳到250mM去elute了，我个人觉得很不妥。
我给你个方案试试：先在50mM之前用低浓度Imidazole，比如30mM或者40mM大量洗洗，5ml柱子建议至少洗200ml。因为你胶上看20mM已经很好的除杂了。其次，50mM到250mM之间多设几个阶梯试试，75mM，100mM，150mM，200mM都要试试，见峰收就行。这样保证会有一个浓度下目的蛋白会很多。通过这些步骤最后的250mM洗下的就可要可不要了。
这样选择纯一点去过Q或者S，或者HP就能进一步纯化了。
希望能帮到你。可以互相交流。
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3楼2012-05-22 17:51:58
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普通回帖

lihuan0525

金虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
尝试其他浓度或者改变PH值，实验只能耐着性子试啊
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2楼2012-05-22 17:50:07
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)

合伙创业版兼职版主

优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
还有就是你的电泳没有marker，哪个才是你的目的条带。
最上边的条带很粗，后边都有洗脱掉，你到底洗脱了多大的体积？
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4楼2012-05-22 18:02:23
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jasco

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.如果是最大的那条带是目的蛋白的话，表达量不算低了，毕竟分子量较大
2.3楼推荐的方法很具体也很实用，同样推荐30-40mM咪唑洗杂，从50mM咪唑就有目的蛋白洗脱来看，拉个75mM，100mM应该差不多了
3.是包涵体的话，还可以看看用什么浓度的尿素或盐酸胍去溶最好，这样起始的杂蛋白就少些
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5楼2012-05-22 20:59:28
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若鱼@@

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by dshlove at 2012-05-22 17:51:58:
建议你先用Imidazole拉个线性试试，最佳浓度能洗下杂蛋白。再用阶梯去洗。不过这只是摸条件用，这样目的蛋白损失会很大。最好的是阶梯洗脱。
对于你这张蛋白胶，不知道你洗杂的量。
我看50mM时候你的目的蛋白就已

银虫兄说的很有道理，我回头尝试一下。
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6楼2012-05-23 09:16:02
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radium4046

铁虫 (初入文坛)
lysis buffer直接加20mM imidazole，有效避免更多杂蛋白结合Ni柱
在50~250mM之间多设几个梯度
要不直接用AKTA拉个线性好了 最直接
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7楼2012-05-25 15:36:22
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
确实，我最喜欢用AKTA。
赞一下 回复此楼
流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
8楼2012-05-26 00:43:45
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