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[求助]
95KD蛋白纯化求助！！！！！！！！
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本人做了一个95KD的聚合酶蛋白，表达量蛮小，纯化过程中遇到了困难。分别用了20mM、50mM和250mM的咪唑溶液进行洗脱，发现在20和50mM低浓度洗脱时候，杂蛋白洗下来很少，250mM咪唑却把大量目的蛋白和杂蛋白一起洗脱下来了，给纯化造成了极大的困难。小弟想请教下各位大侠有什么高招给解决下。  SDS图谱 |
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5楼2012-05-22 20:59:28
lihuan0525
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2楼2012-05-22 17:50:07
dshlove
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
silicare: 金币+6, BioEPI+1, 应助指数+1, 有道理 2012-05-22 18:00:54
若鱼@@: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-05-23 09:09:52
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silicare: 金币+6, BioEPI+1, 应助指数+1, 有道理 2012-05-22 18:00:54
若鱼@@: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-05-23 09:09:52
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建议你先用Imidazole拉个线性试试，最佳浓度能洗下杂蛋白。再用阶梯去洗。不过这只是摸条件用，这样目的蛋白损失会很大。最好的是阶梯洗脱。 对于你这张蛋白胶，不知道你洗杂的量。 我看50mM时候你的目的蛋白就已经开始下来了，而后面你直接跳到250mM去elute了，我个人觉得很不妥。 我给你个方案试试：先在50mM之前用低浓度Imidazole，比如30mM或者40mM大量洗洗，5ml柱子建议至少洗200ml。因为你胶上看20mM已经很好的除杂了。其次，50mM到250mM之间多设几个阶梯试试，75mM，100mM，150mM，200mM都要试试，见峰收就行。这样保证会有一个浓度下目的蛋白会很多。通过这些步骤最后的250mM洗下的就可要可不要了。 这样选择纯一点去过Q或者S，或者HP就能进一步纯化了。 希望能帮到你。可以互相交流。 |
3楼2012-05-22 17:51:58
silicare
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4楼2012-05-22 18:02:23
