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[交流]
【求助/交流】如何高度纯化蛋白，急急急 已有7人参与
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| 我是用strep-tag，纯化蛋白后跑sds-page，总是有很多扎带，如何能高度纯化蛋白呢，就只得到目的条带 |
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我搞蛋白晶体的，我们对蛋白的要求一般来说不低于95%。或者考蓝染色咋带较少。 根据我现在的经验来说想通过亲和层析一步获得较高纯度蛋白除非挂柱后同时再使用酶切标签，其他情况下很难做到亲和一步就获得高纯的蛋白。我们更多或采取再次使用离子交换层析，这一步可以较大的提高蛋白的纯度。最后使用凝胶过滤层析看蛋白的均一性是否良好。我的经验是不要对凝胶过滤层析这种方法报很大希望，这一步对于蛋白纯度的提高贡献很小，除非是你的蛋白和杂蛋白分子量差距巨大（几十KD）！ |
8楼2010-08-11 23:38:58
sqhnsd
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3楼2010-08-11 13:49:49
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lstt09nk(金币+3):淀粉酶，很热心~ 2010-08-11 18:03:37
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有标签，亲和层析还有很多杂带就少见了。建议考虑下换标签，例如his-tag。 不建议像2楼说的用SDS-PAGE来做蛋白质回收，用SDS FREE的，不用做复性了，复性不是每个蛋白质都容易做得出来的。如果你的蛋白质表现出来的活性易于鉴别的的，可以考虑切胶洗脱。 3楼说的分子筛，如果是预装柱，上样量一般推荐为柱床体积的1%，这样要获得足够蛋白质就必须要极浓的蛋白质。而且过柱时流速推荐不大于1毫升每分钟，加上平衡和完事后洗柱保存，时间投入极大。不如先试一下离子交换，低盐上样高盐洗脱的，盐离子不高的话，很多蛋白质都没事，而且流速可高达5毫升每分钟。如果高盐也可耐受，还可以做疏水层析。 如果不行，就换标签his吧，省事。 |
4楼2010-08-11 14:38:52
jasco
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