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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)

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[交流] 【求助/交流】请教如何用乙醇沉淀法纯化回收DNA

最近做文库，插入片段（PCR产物）用量太大，远远超出普通纯化柱子的负载量，而且还需要最终纯化后浓度较高，所以多个柱子分开回收也不可行。于是想起了乙醇沉淀。

向各位请教protocol，
另外，乙醇沉淀之前怎样去除蛋白（比如PCR反应里的酶）？

或者，如果有商业化的类似此功能的试剂盒，更好。

[ Last edited by gongeleven on 2011-1-27 at 09:20 ]

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1楼 2011-01-27 09:12:11

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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

gongeleven(金币+5): 谢谢！我的文库大小需要达到10e9，而且转化效率不如Ecoli，所以需要的DNA多。 2011-01-28 09:24:10

作文库需要用这么多PCR产物么？？？？

想出去蛋白的话，乙醇沉淀之前先将PCR产物加TE稀释至一个相对较大的体积，然后用酚氯仿抽提一次即可。取水相进行乙醇沉淀。

沉淀很固定的protocol就可以： 2.5体积的冰乙醇，0.1体积的 3M 醋酸钠；可以低温放置一会儿，离心沉淀；弃上清，用70%乙醇洗盐；离心弃乙醇，风干重新溶于TE中即可。

我还是想问我最先问的那个问题。我建过基因组文库和16S文库，也没用用很多DNA或者PCR产物啊，50ul PCR的量就足够挑数千个克隆了。

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