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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】水抽提法 DNA提取
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@无花棉@

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】水抽提法 DNA提取

从资料中看到下面一段话：
水抽提法：利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66% ?80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS.
      请问哪位虫友用该方法提取过核酸，效果如何？上面的方法步骤是否完整？谢谢！！
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1楼 2011-03-18 15:56:43
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shaquila

金虫 (正式写手)
★
@无花棉@(金币+1): 2011-03-18 16:22:37
lstt09nk(金币+1): 鼓励交流 2011-03-19 12:52:40
这个方法的效率一定很低，而且杂质很多，没有除蛋白的步骤啊
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2楼2011-03-18 16:15:16
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@无花棉@

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by shaquila at 2011-03-18 16:15:16:
这个方法的效率一定很低，而且杂质很多，没有除蛋白的步骤啊

你好，问一个弱弱的问题，加入SDS的话，是不是会和蛋白质形成复合物，离心的话会不会沉淀出来，这样可以理解成除蛋白步骤吗？
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4楼2011-03-18 16:24:37
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shaquila

金虫 (正式写手)
@无花棉@(金币+1): 2011-03-18 21:20:07
@无花棉@(金币+5): O(∩_∩)O谢谢 2011-03-18 21:20:32
用SDS除蛋白，你在哪步加，然后通过沉淀去除？？
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5楼2011-03-18 19:12:36
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@无花棉@

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by shaquila at 2011-03-18 19:12:36:
用SDS除蛋白，你在哪步加，然后通过沉淀去除？？

一开始就加吧，SDS的作用不是破坏细胞膜，解离核蛋白，还能与蛋白质结合成沉淀吗？资料中提到的那步离心，是不是就可以把这种复合体给沉淀出来，取上清液就可以了呢？
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6楼2011-03-18 21:19:39
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shaquila

金虫 (正式写手)
★ ★
lstt09nk(金币+2): 感谢参与欢迎常来 2011-03-19 12:52:58
@无花棉@(金币+1): 谢谢！ 2011-03-19 19:08:40
如果你是要用SDS沉淀蛋白，在DNA溶出后添加适量kcl，离心去蛋白效果更好～～
而后面nacl＋乙醇沉淀步骤，加入的Nacl量似乎没有那么多，沉淀DNA只要10% 3M 醋酸钠即可，如果你前边加入了Kcl，后面的醋酸钠量可以再减少～～
后面的步骤可以参考DNA纯化的步骤，醋酸钠和乙醇加进去以后可以放到－20度 30分钟（一定要混匀）
我估计你这个文献是很早的文献，其实提DNA的方法都差不多，裂解，去蛋白，纯化，你可以先试试，不行在用CTAB法，这个效果很好

[ Last edited by shaquila on 2011-3-19 at 10:33 ]
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7楼2011-03-19 10:29:29
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rioarsenal

金虫 (正式写手)
★
lstt09nk(金币+1): 感谢参与 2011-03-19 12:53:46
@无花棉@(金币+2): 谢谢 2011-03-19 19:08:25
建议楼主好好看《分子克隆实验指南》，里面关于DNA提取的方法非常好，不要乱找资料。
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8楼2011-03-19 10:41:26
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@无花棉@

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by rioarsenal at 2011-03-19 10:41:26:
建议楼主好好看《分子克隆实验指南》，里面关于DNA提取的方法非常好，不要乱找资料。

谢谢你的建议！我不是学生物的，不是特别懂，只是想找提取率最大的方法。谢谢，我再好好看看。
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9楼2011-03-19 19:08:12
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shaquila

金虫 (正式写手)
@无花棉@(金币+2): 2011-03-20 09:05:30
那楼主如果是初学，那就按经典法提吧
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10楼2011-03-19 23:32:04
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@无花棉@

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by shaquila at 2011-03-19 23:32:04:
那楼主如果是初学，那就按经典法提吧

谢谢。CTAB法我查阅了很多资料，导师最后否认了这种方法，原因是觉得最终得率太低，要求最好用工业提取法。再次感谢！！
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11楼2011-03-20 09:08:39
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wylee01

禁虫 (正式写手)
@无花棉@(金币+2): 请问有更简单的步骤吗？ 2011-03-20 13:37:42
本帖内容被屏蔽
12楼2011-03-20 12:51:06
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wylee01

禁虫 (正式写手)
@无花棉@(金币+3): 谢谢！！ 2011-03-20 17:00:13
本帖内容被屏蔽
13楼2011-03-20 14:59:29
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shaquila

金虫 (正式写手)
@无花棉@(金币+2): 谢谢！！ 2011-03-20 18:45:19
lz，用CTAB的得率很高的，做southern的DNA我全部用这个提的，25毫升管提的，够做10次，而且纯度挺高的，如果蛋白要除得彻底可以用酚抽提，但是会损失10-30%的DNA
ls用的和CTAB差不多吧，酚氯仿加上异戊醇效果更好

[ Last edited by shaquila on 2011-3-20 at 17:59 ]
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14楼2011-03-20 17:55:00
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@无花棉@

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by shaquila at 2011-03-20 17:55:00:
lz，用CTAB的得率很高的，做southern的DNA我全部用这个提的，25毫升管提的，够做10次，而且纯度挺高的，如果蛋白要除得彻底可以用酚抽提，但是会损失10-30%的DNA
ls用的和CTAB差不多吧，酚氯仿加上异戊醇效果更好 ...

非常感谢！我之前一直考虑用CTAB，方案写好后，导师就让我放弃该方法，说提出来的量太少了（因为提完之后是要上小鼠的）。我觉得只有尝试一下才能知道结果。既然你也提到得率很高，我觉得很有必要自己偷着试试。。。
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15楼2011-03-20 18:48:34
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restart20103楼
2011-03-18 16:16   回复  
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