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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】蛋白降解严重，求救！
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sxxuan

金虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】蛋白降解严重，求救！

先谢谢大家看我的贴子，也请大家耐心的看完，帮助我解决问题，非常感谢！
我现在做的是假病毒的原核表达。假病毒会把目的基因包裹在里面，形成病毒蛋白颗粒。
我的实验步骤是这样的：
1.构建好假病毒表达载体，即把目的基因与假病毒序列及pET28a连在一起，转化BL21
2.IPTG诱导表达。
3.离心收集菌体，加入超声buffer（加入溶菌酶及PMSF），37摄氏度摇1h
4.超声破碎，工作5s，间歇5s，时间为1min，做10次
5.离心30min，收集上清
6.超声上清用RNase和DNase双酶消化1h，加入0.5M的EDTA把酶灭活
这样得到的超声上清含有我所需要的病毒蛋白颗粒

问题是：
一开始的时候诱导表达的浓度都很高，要稀释几个数量级才能用。但是随着时间推移，一直做下来，诱导表达量变得很低，双酶消化后检查病毒颗粒的浓度，也越来越低，三四个月下来，起码降了三个数量级。

请问：
我的实验步骤中有没有要注意的地方，或做错的地方？
蛋白降解这么严重的原因有哪些？
我该如何防止？

谢谢！
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1楼 2011-02-18 12:21:49
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wuw579

铁杆木虫 (正式写手)
★
sxxuan(金币+1): 2011-02-18 14:28:04
dhd997(金币+1): 鼓励交流 2011-02-19 10:45:49
制备蛋白的时候加点蛋白酶抑制剂 如PMSF
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2楼2011-02-18 13:25:23
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by wuw579 at 2011-02-18 13:25:23:
制备蛋白的时候加点蛋白酶抑制剂 如PMSF

谢谢
是制备的那一个步骤加？我在超声buffer中加了PMSF
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3楼2011-02-18 14:27:40
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rioarsenal

金虫 (正式写手)
sxxuan(金币+1): 2011-02-21 09:32:44
蛋白酶降解啊
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4楼2011-02-18 14:34:48
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qjy_134

铜虫 (小有名气)
sxxuan(金币+1): 2011-02-21 09:32:49
你最后需要把这个东西做成什么样子
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5楼2011-02-18 15:04:07
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jiangxue82

木虫 (著名写手)
sxxuan(金币+1): 2011-02-21 09:31:40
不懂，祝福！
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6楼2011-02-18 15:23:28
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sxxuan

金虫 (著名写手)
★
dhd997(金币+1): 鼓励交流 2011-02-19 10:46:07
引用回帖:
Originally posted by qjy_134 at 2011-02-18 15:04:07:
你最后需要把这个东西做成什么样子

超声上清用RNase和DNase消化宿主基因组DNA后，就稀释到需要的浓度，提取核酸就可以了
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2011-02-18 15:23:54
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by jiangxue82 at 2011-02-18 15:23:28:
不懂，祝福！

谢谢！
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8楼2011-02-18 15:24:26
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wuw579

铁杆木虫 (正式写手)
sxxuan(金币+1): 2011-02-21 09:31:53

浓度加对了吗   PMSF很容易降解的  要不时的补加
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9楼2011-02-18 19:18:55
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王会征

铁杆木虫 (著名写手)
★
dhd997(金币+1): 又见了，欢迎常来。 2011-02-19 12:43:46
sxxuan(金币+1): 2011-02-21 09:32:31

尽量缩短操作时间，一口气做完
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11楼2011-02-19 11:42:17
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by sxxuan at 2011-02-18 07:24:26:
谢谢！

嗯，只是加了PMSF，然后反应一个小时就算了～
这样也可以吗？
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12楼2011-02-21 09:32:24
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zyxme10楼
2011-02-18 19:32   回复  
sxxuan(金币+1): 2011-02-21 09:33:06
xiaozijiang13楼
2012-08-01 10:27   回复  
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