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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » WB检测磷酸化蛋白
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本帖产生 3 个 BioEPI ，点击这里进行查看

geek23

木虫 (小有名气)

[求助] WB检测磷酸化蛋白

各位大侠,有用过CST的磷酸化抗体检测磷酸化蛋白的吗?请问在整个提蛋白以及WB过程中有什么注意事项?小女最近做了几个抗体都没有条带.急~~~
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Bethechangeyouwishtosee.
1楼2011-08-15 10:23:24
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

geek23

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


silicare(金币+5, BioEPI+1): 谢谢参与 2012-02-20 12:45:53
引用回帖:
23楼: Originally posted by zplipeng at 2011-12-13 22:40:05:
问几个比较细的问题：
1、楼主提取的细胞是贴壁的吗？是先消化再加裂解液还是直接向培养皿中加裂解液？我尝试了一下在培养皿（10cm）中加裂解液（300ul），因为不能加的少（盖不过来），最后提取的蛋白只有3mg ...

1关于细胞裂解:我们一般先收集细胞再加入裂解液,裂解液的体积根据细胞的多少而定,不要太多,一般我们10厘米的盘子80%的细胞加200微升左右裂解液,然后裂解15-20分钟,每隔两分钟vortex一下(15s).然后13000rpm 离心30分钟,取上清.
2关于上样量:这个根据你要检测的蛋白在你细胞中的表达情况,一般表达量高达的,如PARP, SURVIVIN之类的我们就加40-50微克,而表达量低的我们也曾经加到100微克以上,当然了这个要求你的蛋白浓度相对较高,否则上样就是个问题.所以对于第一次做的蛋白,建议你先查文献,看看别人文献里报道该蛋白在特定细胞中的表达情况,再决定上样量.
3关于转膜:我们一般是恒压,100v转一个小时,100kd以上的就是一个半小时.注意电流不能太大,转膜槽里加转子,防止局部温度过高,必要时加冰壶,冰浴转膜.
4β-actin不好看的问题:这个和你的上样量还有上样体积有很大关系,如果体积过大的话,β-actin跑成一条线的问题很常见,我们经常遇到,个人觉得只要β-actin的量基本是一致的,好不好看不重要,呵呵 个人意见哈~
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zplipeng
Bethechangeyouwishtosee.
24楼2011-12-14 13:22:55
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普通回帖

AZURESKY1999

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

也想做此类相关的课题，但并不是太懂，友情帮顶
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2楼2011-08-15 16:26:06
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qingyuansw20

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
adslye(金币+1): 鼓励交流~祝顺利！ 2011-08-15 17:49:33
geek23(金币+5): 请问楼上.我主要是做药物处理后一些蛋白的表达,我一般是加药后48H提蛋白.你的意思是说缩短时间间隔吗?谢谢你的回答. 2011-08-16 16:49:42
CST的抗体应该不错，但不知你的是单克隆还是多克隆，没有条带，是不是磷酸化没有形成。磷酸化有时形成的时间比较短，做实验时要严格对待。
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3楼2011-08-15 16:48:37
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geek23

木虫 (小有名气)
请问楼上.我主要是做药物处理后一些蛋白的表达,我一般是加药后48H提蛋白.你的意思是说缩短时间间隔吗?谢谢你的回答.
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Bethechangeyouwishtosee.
4楼2011-08-16 16:49:04
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zengzhao_1

银虫 (小有名气)
不知道你做的蛋白分子怎样，在我的实验中做了时间点，因为磷酸化只是一个短暂的过程，你还抓住点才行。另外裂解细胞的时候，一定要加磷酸酶抑制剂。
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肇罩
5楼2011-08-16 17:54:43
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qingyuansw20

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
adslye(金币+3): 认真的回复，感谢您~祝顺利！ 2011-08-17 10:31:21
引用回帖:
3楼: Originally posted by qingyuansw20 at 2011-08-15 16:48:37:
CST的抗体应该不错，但不知你的是单克隆还是多克隆，没有条带，是不是磷酸化没有形成。磷酸化有时形成的时间比较短，做实验时要严格对待。

1、看文献，看看攻略，到底你这个实验条件下什么时间，多大浓度才有最好的磷酸化。
2、可以自己摸，不同时间如6h、18h、36h、54h。四个条件分别做，找出两个时间段较好结果，然后取中间时间再试验。
3、最后能找个已经报道过的成熟的刺激条件，无论是什么药的。（阳性对照），提出蛋白看有没有磷酸化形成。排除是你wb的实验问题。要是wb没问题那就肯定是没形成磷酸化。
4、实验就是这样自己一点一点摸。
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6楼2011-08-16 18:37:57
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geek23

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zengzhao_1 at 2011-08-16 17:54:43:
不知道你做的蛋白分子怎样，在我的实验中做了时间点，因为磷酸化只是一个短暂的过程，你还抓住点才行。另外裂解细胞的时候，一定要加磷酸酶抑制剂。

谢谢你的回复~~~
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Bethechangeyouwishtosee.
7楼2011-08-16 20:10:24
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geek23

木虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by qingyuansw20 at 2011-08-16 18:37:57:
1、看文献，看看攻略，到底你这个实验条件下什么时间，多大浓度才有最好的磷酸化。
2、可以自己摸，不同时间如6h、18h、36h、54h。四个条件分别做，找出两个时间段较好结果，然后取中间时间再试验。
3、最后能 ...

大虾的回复真是太有用了!真的很谢谢!
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Bethechangeyouwishtosee.
8楼2011-08-16 21:05:30
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kikie

木虫 (正式写手)
★ ★
adslye(金币+2): 反映的问题很对，感谢您的参与，祝顺利！ 2011-08-17 10:31:53
还有要看条带大小，100kb和17kb的蛋白使用的分离胶浓度显然不是一回事。求助的时候具体说说，自己的蛋白大小，实验中是否未磷酸化的蛋白有条带，等等。
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性痴则志凝，故书痴者文必工，艺痴者技必良；世之落拓无成者，皆自谓不痴者也
9楼2011-08-17 09:38:03
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geek23

木虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by kikie at 2011-08-17 09:38:03:
还有要看条带大小，100kb和17kb的蛋白使用的分离胶浓度显然不是一回事。求助的时候具体说说，自己的蛋白大小，实验中是否未磷酸化的蛋白有条带，等等。

谢谢你的回答.
实验中所要检测的几个蛋白都是50-60KD之间.用的12%的分离胶.结果是都没有出现条带.会不会是蛋白降解, 蛋白保存在�?20度.反复冻融过三次.
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Bethechangeyouwishtosee.
10楼2011-08-17 11:03:59
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