应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » WB检测蛋白表达量时关于上样量的问题？
171/2返回列表12下一页
查看: 16164  |  回复: 16
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

hiusifhd

银虫 (初入文坛)

[求助] WB检测蛋白表达量时关于上样量的问题？ 已有2人参与

我做WB检测蛋白表达量时，是先做个SDSPAGE测出蛋白浓度，然后将总蛋白定量一致，方法是按测出的蛋白量加4×上样缓冲液（3:1）,然后用1×上样缓冲液都补至每孔15微升。可是跑的时候发现条带跑的很不齐，跑了很多次都是这样。首先我认为不是配胶的问题，因为拿同时配的胶上等体积样品时跑的效果很好，我猜测是不是我的上样方法不对？望指教
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-11-10 10:42:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

晴天1882

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-10 16:19:06
1：BCA测总蛋白浓度，然后根据此调整上样量
2：只跑内参，把内参跑成一致，根据此调整上样量
赞一下(1人) 回复此楼
人有绝交，才有至交！
4楼2013-11-10 14:21:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-11-10 13:55:59
为什么要用SDS-PAGE测蛋白浓度？有很多更准确简便的方法测复杂样品的蛋白浓度。你的样品是单一蛋白吗？
赞一下 回复此楼
2楼2013-11-10 13:06:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

樱落feng

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-11-10 16:17:50
有可能是配胶后拔梳子的时候用力不均匀或者是电泳缓冲液加得不够，导电不均匀。
赞一下 回复此楼
努力活着，努力微笑
3楼2013-11-10 14:02:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hiusifhd

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-10 13:06:27
为什么要用SDS-PAGE测蛋白浓度？有很多更准确简便的方法测复杂样品的蛋白浓度。你的样品是单一蛋白吗？

样品是杂蛋白，实验是想首先统一总蛋白量，然后WB检测其中某种蛋白的表达情况，我是不确定我这样的上样方式是否正确，或者是其它地方有问题，重复了两次，跑胶的溴酚蓝指示线都不整齐，而且跑的好慢。
赞一下 回复此楼
5楼2013-11-10 15:51:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by hiusifhd at 2013-11-10 15:51:16
样品是杂蛋白，实验是想首先统一总蛋白量，然后WB检测其中某种蛋白的表达情况，我是不确定我这样的上样方式是否正确，或者是其它地方有问题，重复了两次，跑胶的溴酚蓝指示线都不整齐，而且跑的好慢。...

杂蛋白一般可以先测定样品的浓度。常用的方法有BCA，Lowry，Bradford。
上样时计算同样的蛋白总量，加水或者50mM Tris pH6.8稀释到相同体积，然后加上样buffer变性蛋白。
赞一下 回复此楼
6楼2013-11-11 02:06:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tbsj666

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是本来样品的buffer组分就影响了跑胶
赞一下 回复此楼
7楼2013-11-11 14:54:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hiusifhd

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-11 02:06:07
杂蛋白一般可以先测定样品的浓度。常用的方法有BCA，Lowry，Bradford。
上样时计算同样的蛋白总量，加水或者50mM Tris pH6.8稀释到相同体积，然后加上样buffer变性蛋白。...

请教下上样buffer的量是按加水之后的总体积计算出来，还是按蛋白量来加。我是用的1×loading buffer来稀释到同体积的，不知道是否可行？
赞一下 回复此楼
8楼2013-11-11 18:31:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by hiusifhd at 2013-11-11 18:31:44
请教下上样buffer的量是按加水之后的总体积计算出来，还是按蛋白量来加。我是用的1×loading buffer来稀释到同体积的，不知道是否可行？...

上样buffer的量根据样品体积+水的体积之和计算。保证每孔中的loading buffer总量是一样的，这样跑出来的胶才漂亮。
赞一下 回复此楼
9楼2013-11-12 10:47:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

doglet

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-11-13 13:41:12
你蛋白裂解的buffer是什么，有时候不同的buffer跑出的结果也不一样，尿素最明显，尤其是8M的，盐酸胍也是，有时候是蛋白没处理好，煮样后，再超声一下会有所改善
赞一下 回复此楼
10楼2013-11-12 10:53:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 hiusifhd 的主题更新
171/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 oeyPlfmMUpOC 2026-09-26 3/150 2026-09-27 09:13 by 4IW0sJvtEqX8
[公派出国] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 GxESXJmptOtQ 2026-09-25 4/200 2026-09-27 06:44 by XgCC8uTcwILl
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 GxESXJmptOtQ 2026-09-25 4/200 2026-09-27 06:42 by XgCC8uTcwILl
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 GxESXJmptOtQ 2026-09-25 4/200 2026-09-27 06:39 by XgCC8uTcwILl
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 GxESXJmptOtQ 2026-09-25 3/150 2026-09-27 06:32 by XgCC8uTcwILl
[找工作] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 3/150 2026-09-27 06:08 by XgCC8uTcwILl
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 3/150 2026-09-27 06:05 by XgCC8uTcwILl
[论文投稿] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 4/200 2026-09-27 05:56 by XgCC8uTcwILl
[考研] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 3/150 2026-09-27 05:56 by XgCC8uTcwILl
[找工作] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +5 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 5/250 2026-09-27 05:53 by XgCC8uTcwILl
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 4/200 2026-09-27 05:50 by XgCC8uTcwILl
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 5/250 2026-09-27 05:44 by XgCC8uTcwILl
[考博] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 3/150 2026-09-27 05:44 by XgCC8uTcwILl
[公派出国] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 4/200 2026-09-27 05:44 by XgCC8uTcwILl
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 6/300 2026-09-27 05:42 by XgCC8uTcwILl
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 PGTSwSC3F6nQ 2026-09-24 7/350 2026-09-25 11:18 by yhq9807
[硕博家园] 上海工程技术大学 激光智能制造课题组 2027级博士研究生招生 +4 oxidpl 2026-09-20 6/300 2026-09-24 20:40 by oxidpl
[教师之家] 课题组招2027级博士 上海工程技术大学 激光智能制造方向 +4 oxidpl 2026-09-20 6/300 2026-09-24 20:37 by oxidpl
[基金申请] 师弟论文见刊大半年才想起来申请专利，还能抢救一下吗？ +4 13108017953 2026-09-21 4/200 2026-09-24 10:06 by kudofaye
[有机交流] 有机合成以后会不会被AI改变？做科研的虫友怎么看 +5 zapen 2026-09-20 8/400 2026-09-23 17:21 by tianxiaoxian
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭