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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » WB检测蛋白表达量时关于上样量的问题？
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hiusifhd

银虫 (初入文坛)

[求助] WB检测蛋白表达量时关于上样量的问题？ 已有2人参与

我做WB检测蛋白表达量时，是先做个SDSPAGE测出蛋白浓度，然后将总蛋白定量一致，方法是按测出的蛋白量加4×上样缓冲液（3:1）,然后用1×上样缓冲液都补至每孔15微升。可是跑的时候发现条带跑的很不齐，跑了很多次都是这样。首先我认为不是配胶的问题，因为拿同时配的胶上等体积样品时跑的效果很好，我猜测是不是我的上样方法不对？望指教
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1楼 2013-11-10 10:42:52
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晴天1882

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-10 16:19:06
1：BCA测总蛋白浓度，然后根据此调整上样量
2：只跑内参，把内参跑成一致，根据此调整上样量
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人有绝交，才有至交！
4楼2013-11-10 14:21:09
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-11-10 13:55:59
为什么要用SDS-PAGE测蛋白浓度？有很多更准确简便的方法测复杂样品的蛋白浓度。你的样品是单一蛋白吗？
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2楼2013-11-10 13:06:27
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樱落feng

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-11-10 16:17:50
有可能是配胶后拔梳子的时候用力不均匀或者是电泳缓冲液加得不够，导电不均匀。
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努力活着，努力微笑
3楼2013-11-10 14:02:53
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hiusifhd

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-10 13:06:27
为什么要用SDS-PAGE测蛋白浓度？有很多更准确简便的方法测复杂样品的蛋白浓度。你的样品是单一蛋白吗？

样品是杂蛋白，实验是想首先统一总蛋白量，然后WB检测其中某种蛋白的表达情况，我是不确定我这样的上样方式是否正确，或者是其它地方有问题，重复了两次，跑胶的溴酚蓝指示线都不整齐，而且跑的好慢。
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5楼2013-11-10 15:51:16
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by hiusifhd at 2013-11-10 15:51:16
样品是杂蛋白，实验是想首先统一总蛋白量，然后WB检测其中某种蛋白的表达情况，我是不确定我这样的上样方式是否正确，或者是其它地方有问题，重复了两次，跑胶的溴酚蓝指示线都不整齐，而且跑的好慢。...

杂蛋白一般可以先测定样品的浓度。常用的方法有BCA，Lowry，Bradford。
上样时计算同样的蛋白总量，加水或者50mM Tris pH6.8稀释到相同体积，然后加上样buffer变性蛋白。
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6楼2013-11-11 02:06:07
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tbsj666

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

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是不是本来样品的buffer组分就影响了跑胶
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7楼2013-11-11 14:54:23
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hiusifhd

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-11 02:06:07
杂蛋白一般可以先测定样品的浓度。常用的方法有BCA，Lowry，Bradford。
上样时计算同样的蛋白总量，加水或者50mM Tris pH6.8稀释到相同体积，然后加上样buffer变性蛋白。...

请教下上样buffer的量是按加水之后的总体积计算出来，还是按蛋白量来加。我是用的1×loading buffer来稀释到同体积的，不知道是否可行？
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8楼2013-11-11 18:31:44
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by hiusifhd at 2013-11-11 18:31:44
请教下上样buffer的量是按加水之后的总体积计算出来，还是按蛋白量来加。我是用的1×loading buffer来稀释到同体积的，不知道是否可行？...

上样buffer的量根据样品体积+水的体积之和计算。保证每孔中的loading buffer总量是一样的，这样跑出来的胶才漂亮。
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9楼2013-11-12 10:47:50
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doglet

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-11-13 13:41:12
你蛋白裂解的buffer是什么，有时候不同的buffer跑出的结果也不一样，尿素最明显，尤其是8M的，盐酸胍也是，有时候是蛋白没处理好，煮样后，再超声一下会有所改善
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10楼2013-11-12 10:53:44
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