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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】同样分子量的蛋白，用Strip buffer来洗掉前一个再检测效果如何？
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

[交流] 【求助/交流】同样分子量的蛋白，用Strip buffer来洗掉前一个再检测效果如何？ 已有3人参与

我有4个蛋白要检测，分别是23、26、30、30kD
23和30我可以剪开，26、30我就没那么大信心了，而且还有两个是30
strip buffer我从来没用过，不知道效果到底如何
这几个蛋白的表达量都不低，所以也不怕strip的时候损失
就是不知道这样做出来的结果，是否还能看出表达差异的趋势？
望有做过的虫友进来交流

100 mM ß-mercapto-ethanol, 2% SDS, 62.5 mM Tris-Cl pH 6.8：
ß-mercaptoethanol 342 µl
20% SDS 5 ml
Tris-Cl pH6.7 3.125 ml
add H2O to 50 ml

这个是查到的比较常用的配方
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1楼 2010-06-22 17:10:56
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lstt09nk

铁杆木虫 (职业作家)

小堂
这个还真是有难度~~虽然不懂，帮顶~
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坚持能无数次改变人生的风景，因为只要路是对的，就不怕远~~~
2楼2010-06-22 18:54:58
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
自顶一个，我印象中有几位虫友是提到过stripping的
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3楼2010-06-23 08:58:59
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dianaofyezi

金虫 (正式写手)
三磷酸腺苷(金币+2):谢谢，我也顶多回收一次 2010-06-23 11:20:29
虽然文献上说strip buffer不会对后面的结果又影响，但是以前我们做过，第二个蛋白还好，到后面的蛋白效果就不是很好了。如果你实在没有办法分开，可以试试。
实验实验么，就是要多多实验才知道结果。
祝你好运！
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52187644
4楼2010-06-23 10:25:31
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
lstt09nk(金币+2):希望你做完之后跟我们大家分享你的结果和经验~~期待中~~ 2010-06-23 12:42:38
今天用了楼顶那个配方做stripping
strip之前发光肉眼可见条带，之后肉眼不见发光，压片3分钟无任何条带、背景
但我还没做重新封闭再检测的步骤
懒，不做了，这次是拿了别人不要的拿来玩的
等下次做自己的样品的时候再试试
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5楼2010-06-23 11:26:51
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
lstt09nk(金币+2):感谢分享~~ 2010-06-24 15:21:33
经师姐提醒，我拿昨天的膜（剪下含有β-actin区域）继续做了这样的实验：
昨天的膜经过Stripping和曝光，无条带
今天我再敷了一次二抗（之前没封闭），是CST的鼠二抗，1：1000
再次曝光，没有条带

证明：之前stripping是连同一抗都洗掉的

然后继续用丽春红染色几秒，发现显出了清晰的长得很像actin的条带，以及其他的蛋白条带，一条条很整齐

证明：stripping并没有洗掉很多已经结合到PVDF膜上的蛋白，只是洗掉了绝大部分的一抗二抗

完毕~~该配方不错~~~
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6楼2010-06-24 11:40:13
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