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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大肠杆菌表达42kd的蛋白，蛋白电泳显示只有35kd，测酶活还比较高，这是怎么回事儿呢？
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fanfei211923

铁虫 (初入文坛)

[求助] 大肠杆菌表达42kd的蛋白，蛋白电泳显示只有35kd，测酶活还比较高，这是怎么回事儿呢？

最近表达一个蛋白，大小约为42kd，用载体pET28(a)，转入到BL21(DE3)表达,37°C,1mMIPTG诱导后，sds-page电泳结果显示只有在35kd处有明显条带，和理论值差7KD,且条带比较深，用超声破壁测酶活，和文献相比较酶活又比较高,这是怎么回事儿呢，之前一直没有条带，重新连接、转化，才有条带竟和理论值差这么多，真是一波三折啊，希望有经验的虫友们帮小弟解决一下这个难题。
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1楼 2012-08-23 23:44:10
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mitocam

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-24 13:47:41
SDSPage测定蛋白质分子量不是很准，特别如果你的蛋白质有修饰，或含有大量碱性或酸性的氨基酸，或大量的疏水性残基，有大的偏差很正常。
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2楼2012-08-24 04:55:21
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dongniaoxin

铁杆木虫 (正式写手)

响当当的木头

【答案】应助回帖

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为了确定是不是你要的蛋白，你可以做western blot鉴定一下
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没有梦就走，没有错就不向谁低头
3楼2012-08-24 08:49:28
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shxteacher

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-24 13:47:50
你可以<1>导入没有目的基因的空质粒pet28a，看是否有内源表达<2>把你的目的基因中插入终止密码子，看看是否依旧有35kda的蛋白质产生，是否酶活很高
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OMG
4楼2012-08-24 09:47:22
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-24 13:48:02
SDS-PAGE毕竟不是准确的方式，有条件的做质谱，最直观了。
还有就是看看你的蛋白是不是提前终止了。
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5楼2012-08-24 09:50:54
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101202139

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-25 19:45:43
首先要看看你表达的蛋白是什么类型的？我们实验室出现这样的情况，实际Kd值要比理论小，很有可能是一种糖蛋白！另外，只要你测酶活的方法是正确的，克隆也是正确的，酶活高这不是好事嘛！
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6楼2012-08-25 10:12:54
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生物-TJAB

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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很有可能啊！理论分子量与表观分子量走了可能差那么多啊！不过还有一种可能就是你的目的基因突变，导致中间形成一个终止密码子，提前终止，导致蛋白变短却有活性。最好打质谱了！准确，放心啊

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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7楼2012-08-26 00:21:58
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danlv

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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引用回帖:
5楼: Originally posted by dshlove at 2012-08-24 09:50:54
SDS-PAGE毕竟不是准确的方式，有条件的做质谱，最直观了。
还有就是看看你的蛋白是不是提前终止了。

蛋白翻译是否提前终止应该从DNA序列上就能看出来的吧？  除了遇到同一个ORF里的终止子还有其他可能的情况吗？
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8楼2012-08-26 13:39:25
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ivyvampire

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

不用那么复杂，把插入进去的序列分析清楚，是否有信号肽，被切割之后就短了，不过信号肽貌似不应该有这么长，要么转录进去的序列不对，是截短的序列，要么表达的蛋白转录后被切割了
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9楼2012-08-27 14:36:48
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lintaosong

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我一般直接做western blot，蛋白电泳看条带不太靠谱，特别对于一些修饰蛋白！
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10楼2012-09-02 11:57:18
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