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xinyaolu

木虫 (小有名气)

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[交流] 【求助/交流】大肠杆菌表达，有蛋白无酶活，如何解决已有5人参与

各位大侠，最近在表达一个100KD左右的蛋白，含有两个二硫键，基因中有稀有密码子，使用了pET32a作为载体，同时用Rosetta-gami作为宿主。25℃诱导，IPTG0.8mM.蛋白电泳有非常明显的条带，但是胞内可溶部分未能测到酶活，同时电泳现实胞内可溶部分也有蛋白条带。请问各位高手，如何优化才能实现蛋白的正确折叠，测到酶活，非常感谢

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1楼 2010-07-15 20:02:22

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zemin_fang

木虫 (正式写手)

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amisking(金币+1):鼓励交流！ 2010-07-15 20:38:45

降低温度和摇床转速，还有就是降低IPTG的诱导浓度

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2楼2010-07-15 20:09:47

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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)

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看天(金币+5):谢谢分享 2010-07-16 11:01:00

第一，分析一下你表达蛋白的来源，原核还是真核。
第二，IPTG浓度有点高，适当降低点。降温就不必了，25度不算高了，如果你想试，16，或20度看看了。但有一种情况，有的酶在降温后表达量上去了，但酶活降低；但在37C可溶表达很少。最终条件你要试一试了。
第三，尽量不要尝试复性，有二硫键的话不容易做。你可以去看看Rosetta-gami中chaperone有哪些，是否有能折叠你目标蛋白的。如果没有，你可以采用的方法：1) 添加指定的chaperone，2）使用通用的chaperone，3）密码子优化一下（这个方法我只是听说过有可能）

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3楼2010-07-16 09:36:31

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