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yanhong2029

金虫 (初入文坛)


[交流] 【求助/交流】枯草中表达外源基因,有蛋白,但是没有酶活,是什么原因? 已有3人参与

来源于大肠杆菌一种变形菌(革兰氏阳性细菌)的外源目的基因,将其克隆至大肠杆菌中表达,能够表达出活性。
      然后将其克隆至枯草芽孢杆菌中表达,采用的是枯草编码30S核糖蛋白rpsD基因的启动子,该启动子是一组成型强启动子。该表达出来的蛋白酶,在作用于底物时需要还原型辅酶I:NADH。
      SDS-PAGE显示有蛋白,但是测定酶活性时一直没有结果? 十分苦恼,未知是什么原因?  是形成包涵体呢? 还是该蛋白在该宿主中虽然表达,但是表达出来的就是没有活性的蛋白?  还是辅酶的原因? 需要如何确定? 还请各位朋友能够帮忙解决! 着急毕业呢!  先谢谢各位了!
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wish0310

至尊木虫 (著名写手)


yanhong2029(金币+1): 2010-06-03 21:35:50
scelab(金币+1):欢迎多来交流!:tiger06: 2010-06-03 23:35:29
鄙人觉得形成包涵体的可能性较小,因其在大肠杆菌里表达有活性。可加辅因子尝试一下,如不行的话,可选取测酶活较快速有效的方法,以便查找无酶活的原因。
2楼2010-06-03 20:36:16
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yanhong2029

金虫 (初入文坛)


引用回帖:
Originally posted by wish0310 at 2010-06-03 20:36:16:
鄙人觉得形成包涵体的可能性较小,因其在大肠杆菌里表达有活性。可加辅因子尝试一下,如不行的话,可选取测酶活较快速有效的方法,以便查找无酶活的原因。

在大肠杆菌中表达所采用的启动子与枯草中是不同的,是否会有影响呢? 谢谢
3楼2010-06-03 21:41:20
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85715623

木虫 (正式写手)

yanhong2029(金币+1): 2010-06-03 22:41:46
因素较多,是什么酶?有无正确折叠?
4楼2010-06-03 22:04:35
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yanhong2029

金虫 (初入文坛)


引用回帖:
Originally posted by 85715623 at 2010-06-03 22:04:35:
因素较多,是什么酶?有无正确折叠?

一种羰基还原酶,作用是将底物中的羰基还原成羟基的。

不知道有无正确折叠,有什么方法可以鉴定吗?  怎样能知道翻译出来的蛋白有没正确折叠呀?
5楼2010-06-03 22:41:17
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