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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】枯草中表达外源基因，有蛋白，但是没有酶活，是什么原因？
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yanhong2029

金虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】枯草中表达外源基因，有蛋白，但是没有酶活，是什么原因？已有3人参与

来源于大肠杆菌一种变形菌（革兰氏阳性细菌）的外源目的基因，将其克隆至大肠杆菌中表达，能够表达出活性。
      然后将其克隆至枯草芽孢杆菌中表达，采用的是枯草编码30S核糖蛋白rpsD基因的启动子，该启动子是一组成型强启动子。该表达出来的蛋白酶，在作用于底物时需要还原型辅酶I：NADH。
      SDS-PAGE显示有蛋白，但是测定酶活性时一直没有结果？ 十分苦恼，未知是什么原因？  是形成包涵体呢？ 还是该蛋白在该宿主中虽然表达，但是表达出来的就是没有活性的蛋白？  还是辅酶的原因？ 需要如何确定？ 还请各位朋友能够帮忙解决！ 着急毕业呢！  先谢谢各位了！
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1楼2010-06-03 20:03:32
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wish0310

至尊木虫 (著名写手)
★
yanhong2029(金币+1): 2010-06-03 21:35:50
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-06-03 23:35:29
鄙人觉得形成包涵体的可能性较小，因其在大肠杆菌里表达有活性。可加辅因子尝试一下，如不行的话，可选取测酶活较快速有效的方法，以便查找无酶活的原因。
赞一下(2人) 回复此楼
2楼2010-06-03 20:36:16
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yanhong2029

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by wish0310 at 2010-06-03 20:36:16:
鄙人觉得形成包涵体的可能性较小，因其在大肠杆菌里表达有活性。可加辅因子尝试一下，如不行的话，可选取测酶活较快速有效的方法，以便查找无酶活的原因。

在大肠杆菌中表达所采用的启动子与枯草中是不同的，是否会有影响呢？ 谢谢
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3楼2010-06-03 21:41:20
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85715623

木虫 (正式写手)
yanhong2029(金币+1): 2010-06-03 22:41:46
因素较多，是什么酶？有无正确折叠？
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4楼2010-06-03 22:04:35
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yanhong2029

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 85715623 at 2010-06-03 22:04:35:
因素较多，是什么酶？有无正确折叠？

一种羰基还原酶，作用是将底物中的羰基还原成羟基的。

不知道有无正确折叠，有什么方法可以鉴定吗？  怎样能知道翻译出来的蛋白有没正确折叠呀？
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5楼2010-06-03 22:41:17
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