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Ag6501

金虫 (正式写手)

[交流] 蛋白酶基因表达,用的Bacillus subtilis系统,但总是表达不出,求高人指点…… 已有11人参与

最近在用Mo Bi Tec的WB800N菌株和pHT43载体这个系统做蛋白酶基因的表达,基因序列全部正确,方法是:1、将转化过的菌株过夜培养,37度,220rpm;2、取菌液100微升转接入新培养基,37度,220rpm,培养至OD600为0.7-0.8之间,加入IPTG使终浓度为1mM;3、继续培养,并让转速降一些,37度,3h;4、检测蛋白酶的表达。
    但始终没有检测到蛋白产物,求各位高人指点,究竟是哪里出了问题,谢谢!

真愁,哎~~~~
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阳光倾城!
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xbl3688

银虫 (正式写手)

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wanhscn(金币+2): 鼓励交流! 2011-11-08 11:29:25
1、你的表达菌株和表达载体都是枯草芽胞杆菌的,在这种菌里面表达本身的影响因素就很多,不能排除是芽胞杆菌本身的问题;
2、有的基因在某个载体上就是不表达,这个PHT43是穿梭载体吗,是的话可以先在大肠杆菌里边诱导试试
生活的乐趣在于善于发现美,学会欣赏美
2楼2011-09-01 20:31:26
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Ag6501

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by xbl3688 at 2011-09-01 20:31:26:
1、你的表达菌株和表达载体都是枯草芽胞杆菌的,在这种菌里面表达本身的影响因素就很多,不能排除是芽胞杆菌本身的问题;
2、有的基因在某个载体上就是不表达,这个PHT43是穿梭载体吗,是的话可以先在大肠杆菌里 ...

是的,是穿梭载体,在大肠杆菌里表达了,就是没有活性。然后又换的这个枯草杆菌系统,结果就是测不到表达,难道是pH值?通氧?IPTG浓度?头大,,,想不明白了……谢谢回帖哦
阳光倾城!
3楼2011-09-08 17:22:08
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speculiar

银虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
楼主,我也做蛋白酶,跟你遇到的问题一样。在大肠杆菌中有表达,但无活性。很崩溃
不知楼主现在进展如何?
4楼2011-11-08 10:25:45
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Ag6501

金虫 (正式写手)

★ ★ ★
wanhscn(金币+3): 鼓励应助! 2011-11-08 11:29:46
引用回帖:
4楼: Originally posted by speculiar at 2011-11-08 10:25:45:
楼主,我也做蛋白酶,跟你遇到的问题一样。在大肠杆菌中有表达,但无活性。很崩溃
不知楼主现在进展如何?

在枯草里表达出了,只是活性比较低,100多个单位,是加了个前肽,结果就表达了。
阳光倾城!
5楼2011-11-08 11:07:30
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speculiar

银虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by Ag6501 at 2011-11-08 11:07:30:
在枯草里表达出了,只是活性比较低,100多个单位,是加了个前肽,结果就表达了。

请问用的是pHt43载体吗?我也在用。这个载体好像在枯草里是氯霉素抗性标记的,但我做的时候发现宿主本身就有氯霉素抗性。不知楼主有没有碰到这样的问题?
还想请教下楼主表达的是哪个家族的蛋白酶?S8?M4?
实验纠结中。谢谢指教
6楼2011-11-10 00:08:18
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Ag6501

金虫 (正式写手)

★ ★ ★
wanhscn(金币+3): 热心的应助! 2011-11-12 09:54:08
引用回帖:
6楼: Originally posted by speculiar at 2011-11-10 00:08:18:
请问用的是pHt43载体吗?我也在用。这个载体好像在枯草里是氯霉素抗性标记的,但我做的时候发现宿主本身就有氯霉素抗性。不知楼主有没有碰到这样的问题?
还想请教下楼主表达的是哪个家族的蛋白酶?S8?M4?
实 ...

我用的宿主载体不是氯霉素抗性的,所以用起来没有问题,你可以把抗性替换掉啊,我是表达一株铜绿假单胞菌的蛋白酶,
阳光倾城!
7楼2011-11-11 15:10:46
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speculiar

银虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
wanhscn: 可重新单独发帖悬赏求助,以增加关注! 2011-11-12 09:54:39
引用回帖:
7楼: Originally posted by Ag6501 at 2011-11-11 15:10:46:
我用的宿主载体不是氯霉素抗性的,所以用起来没有问题,你可以把抗性替换掉啊,我是表达一株铜绿假单胞菌的蛋白酶,

还想请教一下,加上前导肽后有没有在大肠杆菌中表达?活性如何?
8楼2011-11-12 01:30:44
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Ag6501

金虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by speculiar at 2011-11-12 01:30:44:
还想请教一下,加上前导肽后有没有在大肠杆菌中表达?活性如何?

加了前肽是有活性的,因为我要表达的蛋白酶原宿主就是革兰氏阴性菌,所以在大肠杆菌中活性非常高,而在枯草中,活性也有,但很低
阳光倾城!
9楼2011-11-12 18:24:42
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kaikai

新虫 (初入文坛)


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楼主,pHT43载体是诱导型的启动子么?分泌到胞外啊?
还有前肽序列楼主是怎么选的?是不是表达蛋白最好加上呢?
10楼2011-11-23 02:45:04
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