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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白酶基因表达，用的Bacillus subtilis系统，但总是表达不出，求高人指点……
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Ag6501

金虫 (正式写手)

[交流] 蛋白酶基因表达，用的Bacillus subtilis系统，但总是表达不出，求高人指点…… 已有11人参与

最近在用Mo Bi Tec的WB800N菌株和pHT43载体这个系统做蛋白酶基因的表达，基因序列全部正确，方法是：1、将转化过的菌株过夜培养，37度，220rpm；2、取菌液100微升转接入新培养基，37度，220rpm，培养至OD600为0.7-0.8之间，加入IPTG使终浓度为1mM；3、继续培养，并让转速降一些，37度，3h；4、检测蛋白酶的表达。
    但始终没有检测到蛋白产物，求各位高人指点，究竟是哪里出了问题，谢谢！

真愁，哎~~~~
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xbl3688 zx6291

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阳光倾城！
1楼 2011-08-26 15:17:00
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xbl3688

银虫 (正式写手)
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wanhscn(金币+2): 鼓励交流！ 2011-11-08 11:29:25
1、你的表达菌株和表达载体都是枯草芽胞杆菌的，在这种菌里面表达本身的影响因素就很多，不能排除是芽胞杆菌本身的问题；
2、有的基因在某个载体上就是不表达，这个PHT43是穿梭载体吗，是的话可以先在大肠杆菌里边诱导试试
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生活的乐趣在于善于发现美，学会欣赏美
2楼2011-09-01 20:31:26
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Ag6501

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xbl3688 at 2011-09-01 20:31:26:
1、你的表达菌株和表达载体都是枯草芽胞杆菌的，在这种菌里面表达本身的影响因素就很多，不能排除是芽胞杆菌本身的问题；
2、有的基因在某个载体上就是不表达，这个PHT43是穿梭载体吗，是的话可以先在大肠杆菌里 ...

是的，是穿梭载体，在大肠杆菌里表达了，就是没有活性。然后又换的这个枯草杆菌系统，结果就是测不到表达，难道是pH值？通氧？IPTG浓度？头大，，，想不明白了……谢谢回帖哦
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阳光倾城！
3楼2011-09-08 17:22:08
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speculiar

银虫 (小有名气)
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楼主，我也做蛋白酶，跟你遇到的问题一样。在大肠杆菌中有表达，但无活性。很崩溃
不知楼主现在进展如何？
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4楼2011-11-08 10:25:45
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Ag6501

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
wanhscn(金币+3): 鼓励应助！ 2011-11-08 11:29:46
引用回帖:
4楼: Originally posted by speculiar at 2011-11-08 10:25:45:
楼主，我也做蛋白酶，跟你遇到的问题一样。在大肠杆菌中有表达，但无活性。很崩溃
不知楼主现在进展如何？

在枯草里表达出了，只是活性比较低，100多个单位，是加了个前肽，结果就表达了。
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阳光倾城！
5楼2011-11-08 11:07:30
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speculiar

银虫 (小有名气)
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5楼: Originally posted by Ag6501 at 2011-11-08 11:07:30:
在枯草里表达出了，只是活性比较低，100多个单位，是加了个前肽，结果就表达了。

请问用的是pHt43载体吗？我也在用。这个载体好像在枯草里是氯霉素抗性标记的，但我做的时候发现宿主本身就有氯霉素抗性。不知楼主有没有碰到这样的问题？
还想请教下楼主表达的是哪个家族的蛋白酶？S8？M4？
实验纠结中。谢谢指教
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6楼2011-11-10 00:08:18
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Ag6501

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
wanhscn(金币+3): 热心的应助! 2011-11-12 09:54:08
引用回帖:
6楼: Originally posted by speculiar at 2011-11-10 00:08:18:
请问用的是pHt43载体吗？我也在用。这个载体好像在枯草里是氯霉素抗性标记的，但我做的时候发现宿主本身就有氯霉素抗性。不知楼主有没有碰到这样的问题？
还想请教下楼主表达的是哪个家族的蛋白酶？S8？M4？
实 ...

我用的宿主载体不是氯霉素抗性的，所以用起来没有问题，你可以把抗性替换掉啊，我是表达一株铜绿假单胞菌的蛋白酶，
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阳光倾城！
7楼2011-11-11 15:10:46
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speculiar

银虫 (小有名气)
★
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wanhscn: 可重新单独发帖悬赏求助,以增加关注! 2011-11-12 09:54:39
引用回帖:
7楼: Originally posted by Ag6501 at 2011-11-11 15:10:46:
我用的宿主载体不是氯霉素抗性的，所以用起来没有问题，你可以把抗性替换掉啊，我是表达一株铜绿假单胞菌的蛋白酶，

还想请教一下，加上前导肽后有没有在大肠杆菌中表达？活性如何？
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8楼2011-11-12 01:30:44
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Ag6501

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by speculiar at 2011-11-12 01:30:44:
还想请教一下，加上前导肽后有没有在大肠杆菌中表达？活性如何？

加了前肽是有活性的，因为我要表达的蛋白酶原宿主就是革兰氏阴性菌，所以在大肠杆菌中活性非常高，而在枯草中，活性也有，但很低
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阳光倾城！
9楼2011-11-12 18:24:42
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kaikai

新虫 (初入文坛)
★
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楼主，pHT43载体是诱导型的启动子么？分泌到胞外啊？
还有前肽序列楼主是怎么选的？是不是表达蛋白最好加上呢？
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10楼2011-11-23 02:45:04
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