应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白酶基因表达，用的Bacillus subtilis系统，但总是表达不出，求高人指点……
201/2返回列表12下一页
查看: 3184  |  回复: 19
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

Ag6501

金虫 (正式写手)

[交流] 蛋白酶基因表达，用的Bacillus subtilis系统，但总是表达不出，求高人指点…… 已有11人参与

最近在用Mo Bi Tec的WB800N菌株和pHT43载体这个系统做蛋白酶基因的表达，基因序列全部正确，方法是：1、将转化过的菌株过夜培养，37度，220rpm；2、取菌液100微升转接入新培养基，37度，220rpm，培养至OD600为0.7-0.8之间，加入IPTG使终浓度为1mM；3、继续培养，并让转速降一些，37度，3h；4、检测蛋白酶的表达。
    但始终没有检测到蛋白产物，求各位高人指点，究竟是哪里出了问题，谢谢！

真愁，哎~~~~
回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

xbl3688 zx6291

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
阳光倾城！
1楼 2011-08-26 15:17:00
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xbl3688

银虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
送鲜花一朵
wanhscn(金币+2): 鼓励交流！ 2011-11-08 11:29:25
1、你的表达菌株和表达载体都是枯草芽胞杆菌的，在这种菌里面表达本身的影响因素就很多，不能排除是芽胞杆菌本身的问题；
2、有的基因在某个载体上就是不表达，这个PHT43是穿梭载体吗，是的话可以先在大肠杆菌里边诱导试试
赞一下(2人) 回复此楼
生活的乐趣在于善于发现美，学会欣赏美
2楼2011-09-01 20:31:26
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Ag6501

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xbl3688 at 2011-09-01 20:31:26:
1、你的表达菌株和表达载体都是枯草芽胞杆菌的，在这种菌里面表达本身的影响因素就很多，不能排除是芽胞杆菌本身的问题；
2、有的基因在某个载体上就是不表达，这个PHT43是穿梭载体吗，是的话可以先在大肠杆菌里 ...

是的，是穿梭载体，在大肠杆菌里表达了，就是没有活性。然后又换的这个枯草杆菌系统，结果就是测不到表达，难道是pH值？通氧？IPTG浓度？头大，，，想不明白了……谢谢回帖哦
赞一下 回复此楼
阳光倾城！
3楼2011-09-08 17:22:08
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

speculiar

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
楼主，我也做蛋白酶，跟你遇到的问题一样。在大肠杆菌中有表达，但无活性。很崩溃
不知楼主现在进展如何？
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2011-11-08 10:25:45
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Ag6501

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
wanhscn(金币+3): 鼓励应助！ 2011-11-08 11:29:46
引用回帖:
4楼: Originally posted by speculiar at 2011-11-08 10:25:45:
楼主，我也做蛋白酶，跟你遇到的问题一样。在大肠杆菌中有表达，但无活性。很崩溃
不知楼主现在进展如何？

在枯草里表达出了，只是活性比较低，100多个单位，是加了个前肽，结果就表达了。
赞一下(1人) 回复此楼
阳光倾城！
5楼2011-11-08 11:07:30
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

speculiar

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by Ag6501 at 2011-11-08 11:07:30:
在枯草里表达出了，只是活性比较低，100多个单位，是加了个前肽，结果就表达了。

请问用的是pHt43载体吗？我也在用。这个载体好像在枯草里是氯霉素抗性标记的，但我做的时候发现宿主本身就有氯霉素抗性。不知楼主有没有碰到这样的问题？
还想请教下楼主表达的是哪个家族的蛋白酶？S8？M4？
实验纠结中。谢谢指教
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2011-11-10 00:08:18
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Ag6501

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
wanhscn(金币+3): 热心的应助! 2011-11-12 09:54:08
引用回帖:
6楼: Originally posted by speculiar at 2011-11-10 00:08:18:
请问用的是pHt43载体吗？我也在用。这个载体好像在枯草里是氯霉素抗性标记的，但我做的时候发现宿主本身就有氯霉素抗性。不知楼主有没有碰到这样的问题？
还想请教下楼主表达的是哪个家族的蛋白酶？S8？M4？
实 ...

我用的宿主载体不是氯霉素抗性的，所以用起来没有问题，你可以把抗性替换掉啊，我是表达一株铜绿假单胞菌的蛋白酶，
赞一下(1人) 回复此楼
阳光倾城！
7楼2011-11-11 15:10:46
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

speculiar

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
wanhscn: 可重新单独发帖悬赏求助,以增加关注! 2011-11-12 09:54:39
引用回帖:
7楼: Originally posted by Ag6501 at 2011-11-11 15:10:46:
我用的宿主载体不是氯霉素抗性的，所以用起来没有问题，你可以把抗性替换掉啊，我是表达一株铜绿假单胞菌的蛋白酶，

还想请教一下，加上前导肽后有没有在大肠杆菌中表达？活性如何？
赞一下(2人) 回复此楼
8楼2011-11-12 01:30:44
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Ag6501

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by speculiar at 2011-11-12 01:30:44:
还想请教一下，加上前导肽后有没有在大肠杆菌中表达？活性如何？

加了前肽是有活性的，因为我要表达的蛋白酶原宿主就是革兰氏阴性菌，所以在大肠杆菌中活性非常高，而在枯草中，活性也有，但很低
赞一下 回复此楼
阳光倾城！
9楼2011-11-12 18:24:42
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kaikai

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
楼主，pHT43载体是诱导型的启动子么？分泌到胞外啊？
还有前肽序列楼主是怎么选的？是不是表达蛋白最好加上呢？
赞一下(1人) 回复此楼
10楼2011-11-23 02:45:04
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 Ag6501 的主题更新
201/2返回列表12下一页
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 LwdutQ8HoqWP 2026-09-13 5/250 2026-09-14 16:25 by Aj1rhIDL5ixY
[教师之家] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 LwdutQ8HoqWP 2026-09-13 4/200 2026-09-14 16:13 by Aj1rhIDL5ixY
[考研] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 LwdutQ8HoqWP 2026-09-13 4/200 2026-09-14 16:12 by Aj1rhIDL5ixY
[找工作] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 4/200 2026-09-14 16:00 by Aj1rhIDL5ixY
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 4/200 2026-09-14 15:57 by Aj1rhIDL5ixY
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 4/200 2026-09-14 15:48 by Aj1rhIDL5ixY
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 4/200 2026-09-14 15:45 by Aj1rhIDL5ixY
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +4 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 4/200 2026-09-14 15:37 by Aj1rhIDL5ixY
[考博] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 4/200 2026-09-14 15:13 by Aj1rhIDL5ixY
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 3/150 2026-09-14 15:09 by Aj1rhIDL5ixY
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 4/200 2026-09-14 15:01 by Aj1rhIDL5ixY
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 6/300 2026-09-14 15:00 by Aj1rhIDL5ixY
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 3/150 2026-09-14 14:57 by Aj1rhIDL5ixY
[考博] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 s3fFTmArrBt6 2026-09-14 3/150 2026-09-14 12:35 by 40ms4Wlo4umh
[基金申请] 求教各位大神：2026教育部人文社科青年基金项目何时公示呀？ +5 云宴山人 2026-09-10 7/350 2026-09-14 12:11 by ecnu2013
[找工作] 浙江师范大学是怎么坑我的 +6 recruit123 2026-09-09 6/300 2026-09-14 12:00 by 萨仁其其格
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 3/150 2026-09-14 10:11 by 23jxep3nCNZb
[教师之家] 浙江师范大学是怎么坑我的 +10 recruit123 2026-09-09 15/750 2026-09-13 10:45 by seaskyy
[基金申请] 面上有专家说实验设备不是我们单位的 +6 zj_muchong 2026-09-08 8/400 2026-09-11 06:56 by suifengdao
[有机交流] 科研求助 10+4 我吃一只鱼 2026-09-07 4/200 2026-09-10 08:32 by 0940628
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭