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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】原核表达羊基因，cDNA长度约为3kb，基因为一种有活性的酶
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tongxinkxy

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】原核表达羊基因，cDNA长度约为3kb，基因为一种有活性的酶

原核表达羊基因，cDNA长度约为3kb，基因为一种有活性的酶
请问是否原核表达就可以？
请问宿主菌或者其他方面有什么注意事项吗？
在原核表达时有什么注意事项吗？
目的序列已经有了，请问设计引物时，是从哪里开始设计引物呢？
谢谢解答，小女子不胜感激
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1楼2010-12-20 19:38:46
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
amisking(金币+2):good！ 2010-12-20 20:53:28
tongxinkxy(金币+1): 2010-12-20 23:10:15
一般从编码的第一个氨基酸开始设计引物
原核表达不一定可行的，偏爱密码子不一样，而且真核生物表达后修饰比较多，比如糖基化，原核生物没有这种功能。
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2楼2010-12-20 20:05:33
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tongxinkxy

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2010-12-20 20:05:33:
一般从编码的第一个氨基酸开始设计引物
原核表达不一定可行的，偏爱密码子不一样，而且真核生物表达后修饰比较多，比如糖基化，原核生物没有这种功能。

是不是我确定目的蛋白翻译后加工确定有糖基化过程，就100%不能用原核表达呢？谢谢
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3楼2010-12-20 20:18:29
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ben1147

木虫 (正式写手)
tongxinkxy(金币+1): 2010-12-20 23:10:00
tongxinkxy(金币+1):2 2010-12-21 13:55:30
引用回帖:
Originally posted by tongxinkxy at 2010-12-20 20:18:29:

是不是我确定目的蛋白翻译后加工确定有糖基化过程，就100%不能用原核表达呢？谢谢

不光糖基化，翻译后修饰很多种的，都要考虑一下。但是即使需要修饰也不一定不能做原核表达，也许只是活性上有差异而已。看你是要干什么用了，测酶学参数？做抗体？
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4楼2010-12-20 22:20:38
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tongxinkxy

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2010-12-20 22:20:38:

不光糖基化，翻译后修饰很多种的，都要考虑一下。但是即使需要修饰也不一定不能做原核表达，也许只是活性上有差异而已。看你是要干什么用了，测酶学参数？做抗体？

应该算是测酶活性吧？就是需要表达后有活性
长度是3k，这在原核表达上是可以实现的吧？

[ Last edited by tongxinkxy on 2010-12-20 at 22:45 ]
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5楼2010-12-20 22:40:38
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
引用回帖:
Originally posted by tongxinkxy at 2010-12-20 22:40:38:

应该算是测酶活性吧？就是需要表达后有活性
长度是3k，这在原核表达上是可以实现的吧？

[ Last edited by tongxinkxy on 2010-12-20 at 22:45 ]

3k，原核完全可以实现。
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6楼2010-12-21 00:55:05
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rioarsenal

金虫 (正式写手)
★ ★
dhd997(金币+2):good 2010-12-21 08:29:53
tongxinkxy(金币+2): 2010-12-21 08:43:06
基因长度不是问题，不过翻译后加工很是问题。

E.coli中表达的蛋白质很多都是包涵体，经过一番折腾，纯化后，活性多少都会损失；

你可以用原核试试，如果活性可以，分离容易，就用。不好用的话，就用酵母好了。
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7楼2010-12-21 02:46:33
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tongxinkxy

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by rioarsenal at 2010-12-21 02:46:33:
基因长度不是问题，不过翻译后加工很是问题。

E.coli中表达的蛋白质很多都是包涵体，经过一番折腾，纯化后，活性多少都会损失；

你可以用原核试试，如果活性可以，分离容易，就用。不好用的话，就用酵母好了。

请问用酵母和细胞有什么区别？
哪个对实验室的要求比较高？
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8楼2010-12-21 08:43:51
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ben1147

木虫 (正式写手)
tongxinkxy(金币+2): 2010-12-21 13:55:55
tongxinkxy(金币+2): 2010-12-21 20:15:14
引用回帖:
Originally posted by tongxinkxy at 2010-12-21 08:43:51:

请问用酵母和细胞有什么区别？
哪个对实验室的要求比较高？

酵母是真核细胞，具有翻译后修饰机制，表达的蛋白和真实情况基本上一样
也可以用枯草芽孢杆菌表达系统，可以是表达产物高效的分泌到胞外，防止包涵体产生。
至于对实验室的要求貌似没什么区别，只要有相应的菌株和载体
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9楼2010-12-21 09:01:35
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rioarsenal

金虫 (正式写手)
tongxinkxy(金币+2): 2010-12-21 13:56:04
tongxinkxy(金币+2): 2010-12-21 20:15:07
引用回帖:
Originally posted by tongxinkxy at 2010-12-21 08:43:51:

请问用酵母和细胞有什么区别？
哪个对实验室的要求比较高？

酵母毕竟是单细胞生物，类似于细菌，培养转化等操作都比较简单，对实验室要求较低，不过由于蛋白质加工系统比较低级，也不是所有的真核蛋白都可以正确表达。

细胞是最适合做真核表达的系统，不过培养和转化等对实验室要求都比较高，也更费钱，楼主可以根据实验室条件来选择
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10楼2010-12-21 09:30:09
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xinzaidongbei

铜虫 (小有名气)
tongxinkxy(金币+2):谢谢支持 2010-12-21 20:14:54
哈哈，就是，我感觉可以试试酵母。
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11楼2010-12-21 20:04:30
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cnb1987

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
2楼: Originally posted by lxj341401 at 2010-12-20 20:05:33
一般从编码的第一个氨基酸开始设计引物
原核表达不一定可行的，偏爱密码子不一样，而且真核生物表达后修饰比较多，比如糖基化，原核生物没有这种功能。

你好，我想问一下，原核表达的话，引物必须从第一个氨基酸开始设计吗？
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12楼2013-06-18 11:37:38
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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12楼: Originally posted by cnb1987 at 2013-06-18 11:37:38
你好，我想问一下，原核表达的话，引物必须从第一个氨基酸开始设计吗？...

一般是的，保证氨基酸的完整性。
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13楼2013-06-18 13:28:10
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cnb1987

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
13楼: Originally posted by lxj341401 at 2013-06-18 13:28:10
一般是的，保证氨基酸的完整性。...

嗯，是的，我是包含整个编码区序列，我的意思是从起始密码子之前设计引物可不可以，还是硬性要求，或者其他原因，比如偏爱密码子之类的，必须从第一个密码子开始。谢谢！
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14楼2013-06-18 14:20:55
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
14楼: Originally posted by cnb1987 at 2013-06-18 14:20:55
嗯，是的，我是包含整个编码区序列，我的意思是从起始密码子之前设计引物可不可以，还是硬性要求，或者其他原因，比如偏爱密码子之类的，必须从第一个密码子开始。谢谢！...

做克隆的话可以从起始密码子之前设计引物，做表达的话不能，在载体上RBS和ATG之间有距离要求的。
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cnb1987
15楼2013-06-18 14:25:19
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cnb1987

银虫 (小有名气)
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15楼: Originally posted by lxj341401 at 2013-06-18 14:25:19
做克隆的话可以从起始密码子之前设计引物，做表达的话不能，在载体上RBS和ATG之间有距离要求的。...

你好，我的意思是在5’非编码区设计引物也不可以？距离要求是多少？
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16楼2013-06-18 15:53:53
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