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毕赤酵母表达出蛋白但没有活性
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各位大虾，小妹最近用毕赤酵母KM71和GS115表达一个水解酶，该酶在原始菌中是分泌表达的。我利用的是pPIC9K质粒，构建的质粒电转进两个宿主，取空的pPIC9K质粒电转酵母细胞作为阴性对照。另外在涂板的时候我把制备的感受态细胞也涂了MD板，没有长出来，感受态应该是没有问题。我是直接用1mg/ml的G418 MD板进行筛选阳性菌落，，过了48小时左右长出菌落，是白色的，形态也很像酵母。将这些菌落接入含有1mg/ml的G418 MD液体培养基，提取基因组用通用引物AOX3'、AOX5'和自己的特异性引物进行PCR都扩出了条带，大小也和目的基因大小相当。之后接种到BMGY培养基，过夜培养后转接到BMMY培养基，每天补加甲醇至终浓度为1%，之后每天取样测酶活，第6天的时候取上清液进行SDS-PAGE检测，有表达条带，大小也和预测的目的蛋白大小相当。但就是没有活性。做了80%硫酸铵沉淀，仍然没有活性。 最近老板催的紧，压力很大。请各位帮我分析分析，我的操作有没有什么问题，大恩不言谢  |
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