[交流] 表达蛋白折叠不正确会有活性麽？

3楼: Originally posted by Marado at 2012-09-20 12:10:17
十分感谢，那如何能够减少标签的二聚体形成呢？
减少温度或者降低IPTG的浓度是否有用？
还有酶切的话，直接对蛋白进行酶切嘛？对蛋白酶切不太了解...

2楼: Originally posted by dshlove at 2012-09-20 11:09:19
GST标签本身就是比较特殊的，表达时候容易形成标签的二聚体，而标签的二聚体是不挂柱的。所以，能用his就用his。
还有就是你说的，可能是温度高了，来不及正确折叠，就把标签给包裹了。
不知道你有没有酶切位点， ...

4楼: Originally posted by dshlove at 2012-09-20 12:41:24
至于二聚体的形成，这好像和你用的质粒还有宿主有关系，涉及基因调控表达方面的了，怎么减少我没具体方案。不过，既然是表达过程形成的，我们可以降低宿主的表达速度，使蛋白有条不紊的折叠，我觉得就能降低二聚体 ...

5楼: Originally posted by Marado at 2012-09-20 12:47:29
行！谢谢了！我考虑做一下低温诱导，还有一个问题就是，我之前250ml菌液，破3秒，停5秒，破碎了将近半小时，都没有透明，还是有很多的白色状沉淀，请问，这个是包涵体麽？...

6楼: Originally posted by dshlove at 2012-09-20 13:24:33
客气了。
你是用超声破碎的吗？一般破碎时候菌液发白，基本就是包涵体很多了。你可以尝试16℃诱导过夜。...

7楼: Originally posted by Marado at 2012-09-20 14:39:45
好的！我是用的超声波破碎的，另外我测序发现在载体区域少了一个碱基，但是两条引物与目的片段都是正确的，不是说开头30个甚至70个bp的碱基都不太准确麽？想求证一下....

8楼: Originally posted by dshlove at 2012-09-20 15:10:45
测序一般是开始的0-50bp左右，由于测序信号不稳定，少量错误可以忽略。还有就是少了的碱基不是在蛋白表达框内，基本不用管。
不知道你的蛋白表达出来在胶上显示的位置对不对。如果你不放心，可以取点样品做下MS检 ...

9楼: Originally posted by Marado at 2012-09-20 15:25:32
蛋白表达后在胶上的位置是对的，我目的蛋白大小约为65k，加上GST一起是91k左右，跟胶上的位置相符....

10楼: Originally posted by dshlove at 2012-09-20 15:40:15
你就继续纯化，个人觉得问题不大。...

11楼: Originally posted by Marado at 2012-09-20 16:10:57
借你吉言了……第一次做表达，做了4个月了，一路磕磕绊绊，心力憔悴，好容易到最后一步纯化了……又遇到槛了……...

12楼: Originally posted by dshlove at 2012-09-20 16:20:31
加油啊，人家CSH做一个蛋白不也用了18个月。出来就好，过程很好的，学到东西多。...

13楼: Originally posted by Marado at 2012-09-20 16:32:24
多谢，以后有问题还要多向你请教....