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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 表达蛋白折叠不正确会有活性麽？
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Marado

金虫 (正式写手)

[交流] 表达蛋白折叠不正确会有活性麽？

如题，37℃，1mMIPTG，6h，表达细胞超声波破碎后，离心，SDS-PAGE显示，上清跟沉淀都有目的蛋白，但是沉淀明显更多，测定了上清酶活（底物为海藻酸钠），有活性，但是做纯化的时候悲剧了，死活挂不上柱子，蛋白都在流川液中.
有朋友说，试试低温诱导，减少包涵体，这里我有几个疑问
1：我上清中明显是有目的蛋白的，也有酶活，为何挂不上柱子，莫非是诱导温度过高，翻译过快，把GST折叠进去了，所以挂不上，但是这样的话，蛋白岂不是也没有活性的？可事实是有的……
2：有表达有酶活是否等于折叠正确？
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1楼 2012-09-20 10:51:12
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dshlove

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 鼓励积极解答问题 2012-09-20 15:37:07
引用回帖:
3楼: Originally posted by Marado at 2012-09-20 12:10:17
十分感谢，那如何能够减少标签的二聚体形成呢？
减少温度或者降低IPTG的浓度是否有用？
还有酶切的话，直接对蛋白进行酶切嘛？对蛋白酶切不太了解...

至于二聚体的形成，这好像和你用的质粒还有宿主有关系，涉及基因调控表达方面的了，怎么减少我没具体方案。不过，既然是表达过程形成的，我们可以降低宿主的表达速度，使蛋白有条不紊的折叠，我觉得就能降低二聚体的形成。
降低温度肯定是要的，IPTG浓度能用低的就不要高的。

酶切是看你在标签和蛋白之间有没有设计相应的酶切位点。比如说TEV，EK之类的特异性位点。
我之前说的酶切是让你检验一下你的标签有没有被包裹，酶切之后会不会影响活性。
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4楼2012-09-20 12:41:24
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dshlove

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
Marado(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+5, 热心的虫虫 2012-09-20 15:36:38
GST标签本身就是比较特殊的，表达时候容易形成标签的二聚体，而标签的二聚体是不挂柱的。所以，能用his就用his。
还有就是你说的，可能是温度高了，来不及正确折叠，就把标签给包裹了。
不知道你有没有酶切位点，酶切之后看看还有没有活性。

酶活和折叠正确与否关系不大，因为每个蛋白或者酶都有一个活性中心，只要这个活性中心没变性，那么酶或者蛋白还是能起作用的。
比如说，肠激酶是两个亚基组成，其实起作用的只是那个轻链。
希望能帮上。
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Marado
2楼2012-09-20 11:09:19
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Marado

金虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by dshlove at 2012-09-20 11:09:19
GST标签本身就是比较特殊的，表达时候容易形成标签的二聚体，而标签的二聚体是不挂柱的。所以，能用his就用his。
还有就是你说的，可能是温度高了，来不及正确折叠，就把标签给包裹了。
不知道你有没有酶切位点， ...

十分感谢，那如何能够减少标签的二聚体形成呢？
减少温度或者降低IPTG的浓度是否有用？
还有酶切的话，直接对蛋白进行酶切嘛？对蛋白酶切不太了解
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3楼2012-09-20 12:10:17
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Marado

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by dshlove at 2012-09-20 12:41:24
至于二聚体的形成，这好像和你用的质粒还有宿主有关系，涉及基因调控表达方面的了，怎么减少我没具体方案。不过，既然是表达过程形成的，我们可以降低宿主的表达速度，使蛋白有条不紊的折叠，我觉得就能降低二聚体 ...

行！谢谢了！我考虑做一下低温诱导，还有一个问题就是，我之前250ml菌液，破3秒，停5秒，破碎了将近半小时，都没有透明，还是有很多的白色状沉淀，请问，这个是包涵体麽？
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5楼2012-09-20 12:47:29
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dshlove

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by Marado at 2012-09-20 12:47:29
行！谢谢了！我考虑做一下低温诱导，还有一个问题就是，我之前250ml菌液，破3秒，停5秒，破碎了将近半小时，都没有透明，还是有很多的白色状沉淀，请问，这个是包涵体麽？...

客气了。
你是用超声破碎的吗？一般破碎时候菌液发白，基本就是包涵体很多了。你可以尝试16℃诱导过夜。
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6楼2012-09-20 13:24:33
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Marado

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by dshlove at 2012-09-20 13:24:33
客气了。
你是用超声破碎的吗？一般破碎时候菌液发白，基本就是包涵体很多了。你可以尝试16℃诱导过夜。...

好的！我是用的超声波破碎的，另外我测序发现在载体区域少了一个碱基，但是两条引物与目的片段都是正确的，不是说开头30个甚至70个bp的碱基都不太准确麽？想求证一下.
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7楼2012-09-20 14:39:45
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dshlove

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by Marado at 2012-09-20 14:39:45
好的！我是用的超声波破碎的，另外我测序发现在载体区域少了一个碱基，但是两条引物与目的片段都是正确的，不是说开头30个甚至70个bp的碱基都不太准确麽？想求证一下....

测序一般是开始的0-50bp左右，由于测序信号不稳定，少量错误可以忽略。还有就是少了的碱基不是在蛋白表达框内，基本不用管。
不知道你的蛋白表达出来在胶上显示的位置对不对。如果你不放心，可以取点样品做下MS检测，再对照序列算出来的理论分子量，看看是不是你的蛋白。
加油！
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8楼2012-09-20 15:10:45
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Marado

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by dshlove at 2012-09-20 15:10:45
测序一般是开始的0-50bp左右，由于测序信号不稳定，少量错误可以忽略。还有就是少了的碱基不是在蛋白表达框内，基本不用管。
不知道你的蛋白表达出来在胶上显示的位置对不对。如果你不放心，可以取点样品做下MS检 ...

蛋白表达后在胶上的位置是对的，我目的蛋白大小约为65k，加上GST一起是91k左右，跟胶上的位置相符.
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9楼2012-09-20 15:25:32
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dshlove

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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9楼: Originally posted by Marado at 2012-09-20 15:25:32
蛋白表达后在胶上的位置是对的，我目的蛋白大小约为65k，加上GST一起是91k左右，跟胶上的位置相符....

你就继续纯化，个人觉得问题不大。
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10楼2012-09-20 15:40:15
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Marado

金虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by dshlove at 2012-09-20 15:40:15
你就继续纯化，个人觉得问题不大。...

借你吉言了……第一次做表达，做了4个月了，一路磕磕绊绊，心力憔悴，好容易到最后一步纯化了……又遇到槛了……
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11楼2012-09-20 16:10:57
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dshlove

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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11楼: Originally posted by Marado at 2012-09-20 16:10:57
借你吉言了……第一次做表达，做了4个月了，一路磕磕绊绊，心力憔悴，好容易到最后一步纯化了……又遇到槛了……...

加油啊，人家CSH做一个蛋白不也用了18个月。出来就好，过程很好的，学到东西多。
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12楼2012-09-20 16:20:31
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Marado

金虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by dshlove at 2012-09-20 16:20:31
加油啊，人家CSH做一个蛋白不也用了18个月。出来就好，过程很好的，学到东西多。...

多谢，以后有问题还要多向你请教.
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13楼2012-09-20 16:32:24
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dshlove

木虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by Marado at 2012-09-20 16:32:24
多谢，以后有问题还要多向你请教....

不客气，互相交流。
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14楼2012-09-20 16:38:32
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枫叶留殇

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我也在做带GST标签的蛋白，请问如果标签2聚后，是不是整个标签+蛋白的分子量都要翻倍了呢。。破菌后，也发现在沉淀里出现蛋白，是不是也要降低一下表达温度和IPTG的浓度呢
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15楼2012-09-22 11:48:35
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junminh

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
条件摸索下，能表达且有活性，结构应该没有问题，应该是纯化的原因
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16楼2012-09-22 13:50:02
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