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表达蛋白折叠不正确会有活性麽？
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如题，37℃，1mMIPTG，6h，表达细胞超声波破碎后，离心，SDS-PAGE显示，上清跟沉淀都有目的蛋白，但是沉淀明显更多，测定了上清酶活（底物为海藻酸钠），有活性，但是做纯化的时候悲剧了，死活挂不上柱子，蛋白都在流川液中. 有朋友说，试试低温诱导，减少包涵体，这里我有几个疑问 1：我上清中明显是有目的蛋白的，也有酶活，为何挂不上柱子，莫非是诱导温度过高，翻译过快，把GST折叠进去了，所以挂不上，但是这样的话，蛋白岂不是也没有活性的？可事实是有的…… 2：有表达有酶活是否等于折叠正确？ |
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 【分子生物】EPI帖 |
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Marado(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+5, 热心的虫虫 2012-09-20 15:36:38
Marado(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+5, 热心的虫虫 2012-09-20 15:36:38
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GST标签本身就是比较特殊的，表达时候容易形成标签的二聚体，而标签的二聚体是不挂柱的。所以，能用his就用his。 还有就是你说的，可能是温度高了，来不及正确折叠，就把标签给包裹了。 不知道你有没有酶切位点，酶切之后看看还有没有活性。 酶活和折叠正确与否关系不大，因为每个蛋白或者酶都有一个活性中心，只要这个活性中心没变性，那么酶或者蛋白还是能起作用的。 比如说，肠激酶是两个亚基组成，其实起作用的只是那个轻链。 希望能帮上。 |
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Marado2楼2012-09-20 11:09:19
3楼2012-09-20 12:10:17
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 鼓励积极解答问题 2012-09-20 15:37:07
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 鼓励积极解答问题 2012-09-20 15:37:07
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至于二聚体的形成，这好像和你用的质粒还有宿主有关系，涉及基因调控表达方面的了，怎么减少我没具体方案。不过，既然是表达过程形成的，我们可以降低宿主的表达速度，使蛋白有条不紊的折叠，我觉得就能降低二聚体的形成。 降低温度肯定是要的，IPTG浓度能用低的就不要高的。 酶切是看你在标签和蛋白之间有没有设计相应的酶切位点。比如说TEV，EK之类的特异性位点。 我之前说的酶切是让你检验一下你的标签有没有被包裹，酶切之后会不会影响活性。 |
4楼2012-09-20 12:41:24
5楼2012-09-20 12:47:29
6楼2012-09-20 13:24:33
7楼2012-09-20 14:39:45
8楼2012-09-20 15:10:45
9楼2012-09-20 15:25:32
10楼2012-09-20 15:40:15
借你吉言了……第一次做表达，做了4个月了，一路磕磕绊绊，心力憔悴，好容易到最后一步纯化了……又遇到槛了…… 11楼2012-09-20 16:10:57
加油啊，人家CSH做一个蛋白不也用了18个月。出来就好，过程很好的，学到东西多。 12楼2012-09-20 16:20:31
13楼2012-09-20 16:32:24
14楼2012-09-20 16:38:32
15楼2012-09-22 11:48:35
16楼2012-09-22 13:50:02
