应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 毕赤酵母表达的蛋白无活性
91/1返回列表
查看: 2993  |  回复: 8
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

兔兔yy070330

铜虫 (初入文坛)

[求助] 毕赤酵母表达的蛋白无活性

各位大虾，我用毕赤酵母KM71和GS115表达我的目的基因（1.8K左右，是酶蛋白），培养5天，每天取样侧活，都没有活性，SDS-PAGE能看到微弱的条带。我是用电转的方法将SacⅠ线性化后的重组质粒导入酵母中的，提取酵母基因组做PCR，用AOX3'和AOX5'做引物，以及特异性引物都能扩出目的条带。现在老板催的紧，心理压力大呀。伤不起伤不起。跪求各位大虾给点建议。谢谢了
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

蛋白表达纯化与检测

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼2011-09-05 20:16:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cexoihtydx

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
adslye(金币+2): 感谢热心应助~祝顺利！ 2011-09-06 13:49:24
问2个问题：
1 对照组：空载酵母菌株同时诱导表达了吗?电泳的淡淡的目的条带是否是酵母的本底表达？
2 确定酶蛋白是分泌表达吗？否则，就需要超声破碎后，再测活性和跑蛋白胶。
赞一下(1人) 回复此楼
不放弃，日子总有阳光，追求总有希望！
2楼2011-09-05 21:02:08
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

兔兔yy070330

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cexoihtydx at 2011-09-05 21:02:08:
问2个问题：
1 对照组：空载酵母菌株同时诱导表达了吗?电泳的淡淡的目的条带是否是酵母的本底表达？
2 确定酶蛋白是分泌表达吗？否则，就需要超声破碎后，再测活性和跑蛋白胶。

我做完电转后，用感受态细胞涂MD板，没有长。用线性化的pPIC9K空质粒分别电转GS115、KM71。相同条件下做了诱导表达，我的目的条带是和对照相比的，对照菌在60KD左右没有条带。另外，我的目的蛋白在原始菌中是分泌到胞外的，9K也是分泌表达的质粒。
赞一下 回复此楼
3楼2011-09-05 21:25:46
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

soso327

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
adslye(金币+2): 感谢您的热心应助! 2011-09-06 13:49:58
很久没做毕赤酵母表达了，以前做过很长一段时间
当时也是电转后，甲醇诱导表达，但是表达时间都在一周以上；
因为菌体生长有个时期，我们一般取生长对数期到稳定期这个阶段的菌群提取蛋白。
还有就是你取样的时候是怎么取的，我们浓缩的时候都特别注意，因为蛋白很容易失活（我们当时好像用的硫酸铵？不太记得额）。希望对你分析有好处~~
赞一下(1人) 回复此楼
人生在于旅程，不在于结果！
4楼2011-09-06 10:18:15
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

兔兔yy070330

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by soso327 at 2011-09-06 10:18:15:
很久没做毕赤酵母表达了，以前做过很长一段时间
当时也是电转后，甲醇诱导表达，但是表达时间都在一周以上；
因为菌体生长有个时期，我们一般取生长对数期到稳定期这个阶段的菌群提取蛋白。
还有就是你取样的时 ...

我是每隔24小时取样，离心用上清测活的，没有活性。之后用80%的硫酸铵沉淀蛋白后测，仍无活性。SDS-PAGE重新检测，是有蛋白表达的。另外，非常感谢帮助
赞一下 回复此楼
5楼2011-09-06 21:56:45
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

skpom

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
从表达载体的构建到连接、转化、筛选、鉴定，现在开始用甲醇诱导，但是测酶活一直没有，跑SDS-PAGE在预计的片段位置有条带（因为外缘表达，蛋白含量低），因为没有合适的抗体不能做Western，蛋白有HIS标签，因为测不出酶活下面没法继续做。
        1、转化子表型鉴定
        2、采用G418浓度梯度筛选毕赤酵母高拷贝转化子
         3、PCR验证毕赤酵母转化子
        4、毕赤酵母中重组蛋白的诱导表达
        5、蛋白质的浓缩
        6、镍离子螯合层析柱纯化角蛋白酶
         7、 重组角蛋白酶酶学性质研究
1、2、3步都得到了满意的结果，可以说明目的基因片段已转进去，但是诱导表达没有酶活，诱导条件是：
        接种于5ml BMGY培养基，于30℃，250rpm摇床培养至OD600为2-6.0，离心收集菌体，转接到装有50ml BMMY培养基的500ml三角瓶中，相同培养条件继续培养，每24小时补加100％甲醇于培养基至终浓度为0.5%，诱导表达7天。
        第二天起每天取2ml样，离心，沉淀和上清分别保存于-20度冰箱留做测酶活和SDS-PAGE，确定最佳收获时间。
        大家看看有什么问题不，请求指教
赞一下(1人) 回复此楼
携手共创科技论坛
6楼2012-03-02 16:42:02
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Allen206

银虫 (小有名气)
首先要确定有没有表达，有表达就是检测体系或者酶本身，是否需要辅助因子，操作是否过硬，
赞一下 回复此楼
不想说什么，，，，
7楼2014-01-08 17:34:53
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liurz

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 兔兔yy070330 at 2011-09-05 21:25:46
我做完电转后，用感受态细胞涂MD板，没有长。用线性化的pPIC9K空质粒分别电转GS115、KM71。相同条件下做了诱导表达，我的目的条带是和对照相比的，对照菌在60KD左右没有条带。另外，我的目的蛋白在原始菌中是分泌到 ...

各位大虾，我用毕赤酵母KM71和GS115表达我的目的基因（1.8K左右，是酶蛋白）
你的蛋白到底多大呢？是1.8K还是60Kd?
赞一下 回复此楼
8楼2014-01-08 19:37:39
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Ivy8023

新虫 (初入文坛)
你好，请问可以求助一株KM71菌株嘛
赞一下 回复此楼
9楼2018-06-27 13:50:31
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 兔兔yy070330 的主题更新
91/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭