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belinda227

木虫 (小有名气)


[交流] 【求助/交流】毕赤酵母胞外表达上清无活性,但胞内测得活性,WHY?

我的蛋白是个同源四聚体,每个亚基的分子量为57KD,是胞内酶,AT含量很高,达到60%。选取亚基的片段与pPICZαA构建了重组表达载体,分别电转化SMD-1168和X-33宿主菌。前期经过抗生素梯度抗性筛选,并经PCR验证正确。根据操作手册,用甲醇诱导其表达,在上清液中一直无法测到酶活。破碎菌体后发现在对照菌和重组菌中均能测到活力,且X-33重组菌的活力是其对照菌的2-3倍。
       这是否说明该酶在胞内表达了?因为未加标签,在SDS-PAGE上无法判断那条带是表达了的重组蛋白。但无法分泌到胞外的原因是因为信号肽还是分子量太大?或者其他原因?请各位毕赤酵母表达高手帮我指点迷津,谢谢了!
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★ ★
dhd997(金币+2): 牛人啊 2011-01-19 09:46:19
belinda227(金币+1): 2011-01-19 19:56:16
酵母表达确实存在有信号肽但是不能分泌表达的现象。
2楼2011-01-18 23:02:46
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)


belinda227(金币+2): 2011-01-21 17:42:16
为啥对照菌株也能检测活性捏 什么基因难道 毕赤酵母本身也有
在毕赤酵母中想表达不出胞外蛋白很正常  我以同学也是想做胞外表达  但是做了好长时间都分泌不出来 最后只能胞内表达了  。。。。不过胞内表达没多少意思。。。麻烦啊
3楼2011-01-21 00:25:34
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belinda227

木虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by fungixx at 2011-01-21 00:25:34:
为啥对照菌株也能检测活性捏 什么基因难道 毕赤酵母本身也有
在毕赤酵母中想表达不出胞外蛋白很正常  我以同学也是想做胞外表达  但是做了好长时间都分泌不出来 最后只能胞内表达了  。。。。不过胞内表达没多少 ...

对 毕赤酵母本身也有的蛋白
4楼2011-01-21 17:41:55
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wyfdgg

新虫 (初入文坛)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
您好,我想咨询一下您是怎么进行菌体破碎的。我遇到了您这边同样的问题,想看一下是不是蛋白在胞内表达了
5楼2015-11-18 10:33:53
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