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belinda227

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[交流] 【求助/交流】毕赤酵母胞外表达上清无活性，但胞内测得活性，WHY?

我的蛋白是个同源四聚体，每个亚基的分子量为57KD，是胞内酶，AT含量很高，达到60%。选取亚基的片段与pPICZαA构建了重组表达载体，分别电转化SMD-1168和X-33宿主菌。前期经过抗生素梯度抗性筛选，并经PCR验证正确。根据操作手册，用甲醇诱导其表达，在上清液中一直无法测到酶活。破碎菌体后发现在对照菌和重组菌中均能测到活力，且X-33重组菌的活力是其对照菌的2-3倍。
这是否说明该酶在胞内表达了？因为未加标签，在SDS-PAGE上无法判断那条带是表达了的重组蛋白。但无法分泌到胞外的原因是因为信号肽还是分子量太大？或者其他原因？请各位毕赤酵母表达高手帮我指点迷津，谢谢了！

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1楼 2011-01-18 16:41:23

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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

★ ★
dhd997(金币+2): 牛人啊 2011-01-19 09:46:19
belinda227(金币+1): 2011-01-19 19:56:16

酵母表达确实存在有信号肽但是不能分泌表达的现象。

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2楼2011-01-18 23:02:46

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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

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belinda227(金币+2): 2011-01-21 17:42:16

为啥对照菌株也能检测活性捏什么基因难道毕赤酵母本身也有
在毕赤酵母中想表达不出胞外蛋白很正常我以同学也是想做胞外表达但是做了好长时间都分泌不出来最后只能胞内表达了。。。。不过胞内表达没多少意思。。。麻烦啊

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3楼2011-01-21 00:25:34

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belinda227

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引用回帖:

Originally posted by fungixx at 2011-01-21 00:25:34:
为啥对照菌株也能检测活性捏什么基因难道毕赤酵母本身也有
在毕赤酵母中想表达不出胞外蛋白很正常我以同学也是想做胞外表达但是做了好长时间都分泌不出来最后只能胞内表达了。。。。不过胞内表达没多少 ...

对毕赤酵母本身也有的蛋白

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4楼2011-01-21 17:41:55

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