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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】毕赤酵母胞外表达上清无活性，但胞内测得活性，WHY?
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belinda227

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】毕赤酵母胞外表达上清无活性，但胞内测得活性，WHY?

我的蛋白是个同源四聚体，每个亚基的分子量为57KD，是胞内酶，AT含量很高，达到60%。选取亚基的片段与pPICZαA构建了重组表达载体，分别电转化SMD-1168和X-33宿主菌。前期经过抗生素梯度抗性筛选，并经PCR验证正确。根据操作手册，用甲醇诱导其表达，在上清液中一直无法测到酶活。破碎菌体后发现在对照菌和重组菌中均能测到活力，且X-33重组菌的活力是其对照菌的2-3倍。
       这是否说明该酶在胞内表达了？因为未加标签，在SDS-PAGE上无法判断那条带是表达了的重组蛋白。但无法分泌到胞外的原因是因为信号肽还是分子量太大？或者其他原因？请各位毕赤酵母表达高手帮我指点迷津，谢谢了！
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1楼 2011-01-18 16:41:23
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belinda227

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by fungixx at 2011-01-21 00:25:34:
为啥对照菌株也能检测活性捏 什么基因难道 毕赤酵母本身也有
在毕赤酵母中想表达不出胞外蛋白很正常  我以同学也是想做胞外表达  但是做了好长时间都分泌不出来 最后只能胞内表达了  。。。。不过胞内表达没多少 ...

对 毕赤酵母本身也有的蛋白
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4楼2011-01-21 17:41:55
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
dhd997(金币+2): 牛人啊 2011-01-19 09:46:19
belinda227(金币+1): 2011-01-19 19:56:16
酵母表达确实存在有信号肽但是不能分泌表达的现象。
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2楼2011-01-18 23:02:46
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)
belinda227(金币+2): 2011-01-21 17:42:16
为啥对照菌株也能检测活性捏 什么基因难道 毕赤酵母本身也有
在毕赤酵母中想表达不出胞外蛋白很正常  我以同学也是想做胞外表达  但是做了好长时间都分泌不出来 最后只能胞内表达了  。。。。不过胞内表达没多少意思。。。麻烦啊
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3楼2011-01-21 00:25:34
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wyfdgg

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
您好，我想咨询一下您是怎么进行菌体破碎的。我遇到了您这边同样的问题，想看一下是不是蛋白在胞内表达了
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5楼2015-11-18 10:33:53
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