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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 毕赤酵母表达的蛋白无活性
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兔兔yy070330

铜虫 (初入文坛)

[求助] 毕赤酵母表达的蛋白无活性

各位大虾，我用毕赤酵母KM71和GS115表达我的目的基因（1.8K左右，是酶蛋白），培养5天，每天取样侧活，都没有活性，SDS-PAGE能看到微弱的条带。我是用电转的方法将SacⅠ线性化后的重组质粒导入酵母中的，提取酵母基因组做PCR，用AOX3'和AOX5'做引物，以及特异性引物都能扩出目的条带。现在老板催的紧，心理压力大呀。伤不起伤不起。跪求各位大虾给点建议。谢谢了
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1楼 2011-09-05 20:16:47
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soso327

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
adslye(金币+2): 感谢您的热心应助! 2011-09-06 13:49:58
很久没做毕赤酵母表达了，以前做过很长一段时间
当时也是电转后，甲醇诱导表达，但是表达时间都在一周以上；
因为菌体生长有个时期，我们一般取生长对数期到稳定期这个阶段的菌群提取蛋白。
还有就是你取样的时候是怎么取的，我们浓缩的时候都特别注意，因为蛋白很容易失活（我们当时好像用的硫酸铵？不太记得额）。希望对你分析有好处~~
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人生在于旅程，不在于结果！
4楼2011-09-06 10:18:15
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cexoihtydx

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
adslye(金币+2): 感谢热心应助~祝顺利！ 2011-09-06 13:49:24
问2个问题：
1 对照组：空载酵母菌株同时诱导表达了吗?电泳的淡淡的目的条带是否是酵母的本底表达？
2 确定酶蛋白是分泌表达吗？否则，就需要超声破碎后，再测活性和跑蛋白胶。
赞一下(1人) 回复此楼
不放弃，日子总有阳光，追求总有希望！
2楼2011-09-05 21:02:08
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兔兔yy070330

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cexoihtydx at 2011-09-05 21:02:08:
问2个问题：
1 对照组：空载酵母菌株同时诱导表达了吗?电泳的淡淡的目的条带是否是酵母的本底表达？
2 确定酶蛋白是分泌表达吗？否则，就需要超声破碎后，再测活性和跑蛋白胶。

我做完电转后，用感受态细胞涂MD板，没有长。用线性化的pPIC9K空质粒分别电转GS115、KM71。相同条件下做了诱导表达，我的目的条带是和对照相比的，对照菌在60KD左右没有条带。另外，我的目的蛋白在原始菌中是分泌到胞外的，9K也是分泌表达的质粒。
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3楼2011-09-05 21:25:46
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兔兔yy070330

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by soso327 at 2011-09-06 10:18:15:
很久没做毕赤酵母表达了，以前做过很长一段时间
当时也是电转后，甲醇诱导表达，但是表达时间都在一周以上；
因为菌体生长有个时期，我们一般取生长对数期到稳定期这个阶段的菌群提取蛋白。
还有就是你取样的时 ...

我是每隔24小时取样，离心用上清测活的，没有活性。之后用80%的硫酸铵沉淀蛋白后测，仍无活性。SDS-PAGE重新检测，是有蛋白表达的。另外，非常感谢帮助
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5楼2011-09-06 21:56:45
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