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【求助/交流】毕赤酵母表达蛋白的奇怪现象
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cai198559
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[交流]
【求助/交流】毕赤酵母表达蛋白的奇怪现象
各位大侠看看有没有见过这种现象!我是将PPICZ&(3.5K)加目的片段(脂肪酶895 bp)转到毕赤酵母X33中去,挑取阳性克隆,测出酶活正常,电泳条带正常(29KD)。理论上29KD的蛋白是不可能透过10KD的超滤膜的,而我将蛋白进行浓缩的时候发现10KD根本起不到浓缩的作用,29KD的蛋白都漏过去了,而酵母自身表达的蛋白却可以浓缩(说明超滤没有问题)。后来我用原始菌产的脂肪酶去超滤,10KD的超滤膜完全能将蛋白截住。我想问下,有没有人遇到过相同的问题,是什么原因!是糖基化程度不够,还是插入的位点不点,还是线性化的位点不对造成的。
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2010-12-02 13:06:45
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austin2008
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★
cai198559(金币
+1
):谢谢参与
有可能是10KD的超滤膜有问题吧,或者是你表达的蛋白不稳定,浓缩过程中被降解了?!既然你检测到酶活了,sds也检测到蛋白了,就不会是表达的问题,和糖基化程度,插入的位点以及线性化的位点都没有啥根本的联系!
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2010-12-02 13:45:45
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沙中清泉
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★
cai198559(金币
+1
):谢谢参与
没有出现过这种问题,换换超滤膜试试
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3楼
2010-12-02 14:48:45
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cai198559
银虫
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引用回帖:
Originally posted by
austin2008
at 2010-12-02 13:45:45:
有可能是10KD的超滤膜有问题吧,或者是你表达的蛋白不稳定,浓缩过程中被降解了?!既然你检测到酶活了,sds也检测到蛋白了,就不会是表达的问题,和糖基化程度,插入的位点以及线性化的位点都没有啥根本的联系!
应该不可能被降解吧 应该超滤过的液体也到检测出酶活 SDS也跑得出来!我那超滤膜过其他的蛋白都没问题!好像不太像超滤管有问题的感觉
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4楼
2010-12-02 20:42:17
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落明逐暗
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cai198559(金币
+1
):谢谢参与
cai198559(金币+1): 2011-03-04 11:18:55
理论上超滤膜会截留大于10KD的蛋白,但是实际上大小于10KD的3倍的蛋白都有可能通过,就是说3KD-30KD的蛋白都有可能通过滤膜。可能刚好你那个蛋白形态也有影响吧。
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2011-03-01 14:58:10
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danbomingyue
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cai198559(金币+1): 谢谢参与
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2012-05-03 17:04:35
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aoaoshch
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cai198559(金币+1): 谢谢参与
用3kDa的超滤管试试吧。
顺便问一下,你的原始产酶菌株是什么?毕赤酵母表达脂肪酶,表达效果好像不会太高吧。偏酸性的环境,对碱性的脂肪酶不利啊……
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7楼
2014-01-09 19:51:54
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2016-10-16 00:37
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