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yuweibest

木虫 (正式写手)

[交流] 毕赤酵母表达(总是整合不上) 已有7人参与

我正在做毕赤酵母表达,前面的一些步骤应该没什么问题。重组质粒已经构建好,就是在重组质粒线性化并且电转化毕赤酵母时,在相应的抗性平板上总是张不出菌落!!。也就是线性整合不上去。
  请问哪位大侠做过这方面,给点提高转化率的建议和改进步骤。
   我用的PgapzαA载体,目的片段为2.9KB(比较大)

[ Last edited by silicare on 2011-5-19 at 21:22 ]
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银杏下

金虫 (小有名气)


yuweibest(金币+1,VIP+0): 12-22 10:16
我之前做过毕赤酵母的电转,每次做基本上都成功了,不知道你是怎么处理感受态细胞的,如果这个步骤出现问题很可能出现无法转化成果,另外还要注意线性化的质粒浓度要高些。你的载体2.9KB已经算是最小的一类的毕赤酵母载体了,所以不要担心载体的问题。
2楼2009-08-13 18:33:36
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yuweibest

木虫 (正式写手)

感受态,我就是按照毕赤酵母操作手册上,离心加水再离心,加山梨醇再离心!不是载体2.9KB!而是目的基因2.9KB!
3楼2009-08-13 19:42:51
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)

电转时的参数(电压,时间)
4楼2009-08-13 20:35:48
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walingliu

铁杆木虫 (著名写手)

毕赤酵母表达体系确实不怎么好弄
失败只有一种那就是半途而废!
5楼2009-08-13 20:56:04
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yuweibest

木虫 (正式写手)

我用的是1.5KV的电压!电容 25µF;电阻 200Ω。电击时间为6ms
6楼2009-08-13 23:29:37
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)

★ ★
yuweibest(金币+1,VIP+0):感谢你的回答!能再来看一下,具体指正一下吗? 8-14 09:36
yuweibest(金币+1,VIP+0): 12-22 10:16
参数很正常
酵母菌浓度尽量高一点
载体尽量不含盐
应该没有问题
7楼2009-08-14 08:14:45
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yuweibest

木虫 (正式写手)

我具体的操作步骤是这样的。首先从保存有重组质粒的菌里,将重组质粒用试剂盒提出来。电泳鉴定后,酶切线性化,并80度灭酶活!然后跑胶进行胶回收。将回收到得重组质粒和酵母感受态混合电转化,涂布在含有相应抗性的平板上。为什么每次要么不张菌,要么张的都是不像酵母的菌落呢?楼上能将你的方法告诉我吗?或者指正一下我的方法!谢谢
8楼2009-08-14 09:36:03
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)

★ ★
yuweibest(金币+1,VIP+0):谢了!总想改进下!苦于没方法! 8-14 20:58
yuweibest(金币+1,VIP+0): 12-22 10:16
如果是抗性筛选的话,电击完加入山梨醇后在30度培养1-2小时再涂板
细胞浓度尽量高一点
9楼2009-08-14 09:49:29
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yuweibest

木虫 (正式写手)

我就是这么搞的!山梨醇1-2小时!完全按照毕赤酵母操作手册上做的!我在考虑是不是片段太大,2.9KB!载体本身也就3.1KB!下次我把质粒和细胞全搞浓一点试一试!
10楼2009-08-14 20:58:16
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