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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于毕赤酵母表达
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简0516单

至尊木虫 (著名写手)

[求助] 关于毕赤酵母表达

各位老师，请教一下，在做毕赤酵母表达时，转到比赤酵母里之后，做PCR鉴定时，能不能直接做菌落PCR?酵母菌的壁又特别厚，该怎么处理呢？
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1楼 2012-03-19 18:53:53
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damoyanyu

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
21楼2012-04-06 18:09:15
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damoyanyu

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
22楼2012-04-06 18:10:57
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普通回帖

墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
简0516单: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 谢谢帮助 2012-04-07 00:09:56
100°水浴5-10min 再立即放入-80冰箱 反复三次后  再用溶菌酶（最好用lyticase)处理  可以菌落PCR 不用酶处理也可能P出来
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简0516单
仕不可不弘毅，任重而道远
2楼2012-03-20 08:51:03
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whb21

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
简0516单: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢帮助 2012-04-07 00:10:14
可以直接做菌落PCR的，不用前期处理也是可以P出来的，你只需要在设定PCR反应条件时95度维持时间稍微长一点就可以了
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简0516单
3楼2012-03-20 09:48:52
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简0516单

至尊木虫 (著名写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by whb21 at 2012-03-20 09:48:52:
可以直接做菌落PCR的，不用前期处理也是可以P出来的，你只需要在设定PCR反应条件时95度维持时间稍微长一点就可以了

非常感谢您的帮助，请问95℃大概维持多长时间呢？我现在用的是10min，没有P出来
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4楼2012-03-20 11:12:03
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简0516单

至尊木虫 (著名写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 墨香若水 at 2012-03-20 08:51:03:
100°水浴5-10min 再立即放入-80冰箱 反复三次后  再用溶菌酶（最好用lyticase)处理  可以菌落PCR 不用酶处理也可能P出来

非常感谢您的帮助，请问在-80要放多长时间呢？溶菌酶的亮要用多少呢？
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5楼2012-03-20 11:14:02
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王雨云

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
实在不行就提基因组DNA，然后再P，我们以前提基因组DNA就是-20度将菌体冻30分钟后直接研磨，然后按一般的提基因组的方法提取就行，如果提出的基因组电泳没看到条带也可以拿去P，因为PCR很灵敏，你知道的
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6楼2012-03-20 11:27:12
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啊Q精神

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
煮冻煮的方法，零下20冻，时间20-30min，煮5min,反复2-3次，上清做PCR
循环数要多，至少30-35吧，模板可以适当多加点。
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7楼2012-03-20 12:10:31
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫
引用回帖:
5楼: Originally posted by 简0516单 at 2012-03-20 11:14:02:
非常感谢您的帮助，请问在-80要放多长时间呢？溶菌酶的亮要用多少呢？

-80 5-10min  你挑的是单菌落 所以溶菌酶只要加一点点 （1ul)
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仕不可不弘毅，任重而道远
8楼2012-03-20 12:41:41
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简0516单

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 王雨云 at 2012-03-20 11:27:12:
实在不行就提基因组DNA，然后再P，我们以前提基因组DNA就是-20度将菌体冻30分钟后直接研磨，然后按一般的提基因组的方法提取就行，如果提出的基因组电泳没看到条带也可以拿去P，因为PCR很灵敏，你知道的

可是我现在在筛选，量很大的，如果都提质粒工作量忒大了
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9楼2012-03-20 12:48:39
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简0516单

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 墨香若水 at 2012-03-20 12:41:41:
-80 5-10min  你挑的是单菌落 所以溶菌酶只要加一点点 （1ul)

在--20可不可以呢？最近--80出了点问题
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10楼2012-03-20 12:49:24
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