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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于毕赤酵母表达
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王雨云

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
简0516单: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 谢谢 2012-04-15 17:21:08
引用回帖:
9楼: Originally posted by 简0516单 at 2012-03-20 12:48:39:
可是我现在在筛选，量很大的，如果都提质粒工作量忒大了

应该是-80度冻融哈，开始说拐了。大量筛选确实这个方法工作量由点大，那就-80度反复冻融，同时还加点溶菌酶吧，不过一般说溶菌酶好像是针对细菌细胞壁的，真菌细胞壁较厚，一般溶菌酶还不容易起作用
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11楼2012-03-20 13:13:15
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zx6291

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以直接做菌落PCR，PCR循环次数40次。
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12楼2012-03-20 13:22:48
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whb21

木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 简0516单 at 2012-03-20 11:12:03:
非常感谢您的帮助，请问95℃大概维持多长时间呢？我现在用的是10min，没有P出来

十分钟觉得差不多，菌量不用很大，要是还不行的话可以用冻融或者溶菌酶处理一下再P
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13楼2012-03-20 15:22:47
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫
引用回帖:
10楼: Originally posted by 简0516单 at 2012-03-20 12:49:24:
在--20可不可以呢？最近--80出了点问题

应该也差不多 试试
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仕不可不弘毅，任重而道远
14楼2012-03-20 16:58:58
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简0516单

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 墨香若水 at 2012-03-20 12:41:41:
-80 5-10min  你挑的是单菌落 所以溶菌酶只要加一点点 （1ul)

单菌落应该溶在多少微升的水里呢？
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15楼2012-03-20 17:02:17
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫

【答案】应助回帖

引用回帖:
15楼: Originally posted by 简0516单 at 2012-03-20 17:02:17:
单菌落应该溶在多少微升的水里呢？

酵母菌落相对大肠比较大 50-100ul都没问题
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仕不可不弘毅，任重而道远
16楼2012-03-21 08:58:27
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
简0516单: 金币+10, ★★★★★最佳答案, 谢谢帮助 2012-04-15 17:21:53
引用回帖:
15楼: Originally posted by 简0516单 at 2012-03-20 17:02:17:
单菌落应该溶在多少微升的水里呢？

加水多少之类都是次要的 你实践下就明白了 不要纠结在这些小问题里面 行动吧
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仕不可不弘毅，任重而道远
17楼2012-03-21 08:59:33
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www21214

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我做过一次，可以取1ml酵母悬液4000rmp离心，pbs重悬，煮沸5mins，放到冰上5mins，直接就可以用做pcr的模板了。效果不错的
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18楼2012-03-21 10:25:20
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skpom

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
简0516单: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 谢谢 2012-04-15 17:21:36
我当时做的时候用过直接做菌落PCR，第一次是5株菌，一株都没有出条带；第二次有2株有条带；第三次做的时候把上次那3株没出条带的带上继续做菌落PCR结果这三株都出现了条带。
所以我认为酵母壁比较厚，进行菌落PCR很有可能P不出来，还有可能出现不准确结果，不如直接提提酵母DNA，每天提24管用不多长时间的，而且很准确，酵母细胞反复冻融几次加蛋白酶K，37度反应一小时加100微升10mol/L的CTAB及80微升5mol/L的Nacl溶液混匀，65度水浴保温20分钟得到粗提取液，然后用酚氯仿异戊醇抽提，后面跟基本DNA提取方法一样。
有什么问题可以再问我。
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携手共创科技论坛
19楼2012-03-21 15:20:13
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萧瑟海风

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我的是用的TIANGEN的酵母基因组提取试剂盒，然后单买一个溶壁酶，就可以提取了，然后PCR，很好用
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20楼2012-04-02 15:10:44
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