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王雨云

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
简0516单: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 谢谢 2012-04-15 17:21:08
引用回帖:
9楼: Originally posted by 简0516单 at 2012-03-20 12:48:39:
可是我现在在筛选,量很大的,如果都提质粒工作量忒大了

应该是-80度冻融哈,开始说拐了。大量筛选确实这个方法工作量由点大,那就-80度反复冻融,同时还加点溶菌酶吧,不过一般说溶菌酶好像是针对细菌细胞壁的,真菌细胞壁较厚,一般溶菌酶还不容易起作用
11楼2012-03-20 13:13:15
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zx6291

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
可以直接做菌落PCR,PCR循环次数40次。
12楼2012-03-20 13:22:48
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whb21

木虫 (著名写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 简0516单 at 2012-03-20 11:12:03:
非常感谢您的帮助,请问95℃大概维持多长时间呢?我现在用的是10min,没有P出来

十分钟觉得差不多,菌量不用很大,要是还不行的话可以用冻融或者溶菌酶处理一下再P
13楼2012-03-20 15:22:47
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫

引用回帖:
10楼: Originally posted by 简0516单 at 2012-03-20 12:49:24:
在--20可不可以呢?最近--80出了点问题

应该也差不多 试试
仕不可不弘毅,任重而道远
14楼2012-03-20 16:58:58
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简0516单

至尊木虫 (著名写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 墨香若水 at 2012-03-20 12:41:41:
-80 5-10min  你挑的是单菌落 所以溶菌酶只要加一点点 (1ul)

单菌落应该溶在多少微升的水里呢?
15楼2012-03-20 17:02:17
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫

【答案】应助回帖

引用回帖:
15楼: Originally posted by 简0516单 at 2012-03-20 17:02:17:
单菌落应该溶在多少微升的水里呢?

酵母菌落相对大肠比较大 50-100ul都没问题
仕不可不弘毅,任重而道远
16楼2012-03-21 08:58:27
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
简0516单: 金币+10, ★★★★★最佳答案, 谢谢帮助 2012-04-15 17:21:53
引用回帖:
15楼: Originally posted by 简0516单 at 2012-03-20 17:02:17:
单菌落应该溶在多少微升的水里呢?

加水多少之类都是次要的 你实践下就明白了 不要纠结在这些小问题里面 行动吧
仕不可不弘毅,任重而道远
17楼2012-03-21 08:59:33
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www21214

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我做过一次,可以取1ml酵母悬液4000rmp离心,pbs重悬,煮沸5mins,放到冰上5mins,直接就可以用做pcr的模板了。效果不错的
18楼2012-03-21 10:25:20
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skpom

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
简0516单: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 谢谢 2012-04-15 17:21:36
我当时做的时候用过直接做菌落PCR,第一次是5株菌,一株都没有出条带;第二次有2株有条带;第三次做的时候把上次那3株没出条带的带上继续做菌落PCR结果这三株都出现了条带。
所以我认为酵母壁比较厚,进行菌落PCR很有可能P不出来,还有可能出现不准确结果,不如直接提提酵母DNA,每天提24管用不多长时间的,而且很准确,酵母细胞反复冻融几次加蛋白酶K,37度反应一小时加100微升10mol/L的CTAB及80微升5mol/L的Nacl溶液混匀,65度水浴保温20分钟得到粗提取液,然后用酚氯仿异戊醇抽提,后面跟基本DNA提取方法一样。
有什么问题可以再问我。
携手共创科技论坛
19楼2012-03-21 15:20:13
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萧瑟海风

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我的是用的TIANGEN的酵母基因组提取试剂盒,然后单买一个溶壁酶,就可以提取了,然后PCR,很好用
20楼2012-04-02 15:10:44
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