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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】毕赤酵母表达蛋白的奇怪现象
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cai198559

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】毕赤酵母表达蛋白的奇怪现象

各位大侠看看有没有见过这种现象！我是将PPICZ&（3.5K）加目的片段（脂肪酶895 bp）转到毕赤酵母X33中去，挑取阳性克隆,测出酶活正常，电泳条带正常（29KD）。理论上29KD的蛋白是不可能透过10KD的超滤膜的，而我将蛋白进行浓缩的时候发现10KD根本起不到浓缩的作用，29KD的蛋白都漏过去了，而酵母自身表达的蛋白却可以浓缩（说明超滤没有问题）。后来我用原始菌产的脂肪酶去超滤，10KD的超滤膜完全能将蛋白截住。我想问下，有没有人遇到过相同的问题，是什么原因！是糖基化程度不够，还是插入的位点不点，还是线性化的位点不对造成的。
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1楼 2010-12-02 13:06:45
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aoaoshch

木虫 (小有名气)
★
cai198559(金币+1): 谢谢参与
用3kDa的超滤管试试吧。
顺便问一下，你的原始产酶菌株是什么？毕赤酵母表达脂肪酶，表达效果好像不会太高吧。偏酸性的环境，对碱性的脂肪酶不利啊……
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7楼2014-01-09 19:51:54
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austin2008

铁杆木虫 (著名写手)
★
cai198559(金币+1):谢谢参与
有可能是10KD的超滤膜有问题吧，或者是你表达的蛋白不稳定，浓缩过程中被降解了？！既然你检测到酶活了，sds也检测到蛋白了，就不会是表达的问题，和糖基化程度，插入的位点以及线性化的位点都没有啥根本的联系！
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2楼2010-12-02 13:45:45
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沙中清泉

木虫 (正式写手)
★
cai198559(金币+1):谢谢参与
没有出现过这种问题，换换超滤膜试试
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3楼2010-12-02 14:48:45
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cai198559

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by austin2008 at 2010-12-02 13:45:45:
有可能是10KD的超滤膜有问题吧，或者是你表达的蛋白不稳定，浓缩过程中被降解了？！既然你检测到酶活了，sds也检测到蛋白了，就不会是表达的问题，和糖基化程度，插入的位点以及线性化的位点都没有啥根本的联系！

应该不可能被降解吧 应该超滤过的液体也到检测出酶活 SDS也跑得出来!我那超滤膜过其他的蛋白都没问题！好像不太像超滤管有问题的感觉
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4楼2010-12-02 20:42:17
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梦想天行8楼
2016-10-16 00:37   回复  
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