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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 毕赤酵母表达的蛋白无活性
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兔兔yy070330

铜虫 (初入文坛)

[求助] 毕赤酵母表达的蛋白无活性

各位大虾，我用毕赤酵母KM71和GS115表达我的目的基因（1.8K左右，是酶蛋白），培养5天，每天取样侧活，都没有活性，SDS-PAGE能看到微弱的条带。我是用电转的方法将SacⅠ线性化后的重组质粒导入酵母中的，提取酵母基因组做PCR，用AOX3'和AOX5'做引物，以及特异性引物都能扩出目的条带。现在老板催的紧，心理压力大呀。伤不起伤不起。跪求各位大虾给点建议。谢谢了
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1楼 2011-09-05 20:16:47
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skpom

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
从表达载体的构建到连接、转化、筛选、鉴定，现在开始用甲醇诱导，但是测酶活一直没有，跑SDS-PAGE在预计的片段位置有条带（因为外缘表达，蛋白含量低），因为没有合适的抗体不能做Western，蛋白有HIS标签，因为测不出酶活下面没法继续做。
        1、转化子表型鉴定
        2、采用G418浓度梯度筛选毕赤酵母高拷贝转化子
         3、PCR验证毕赤酵母转化子
        4、毕赤酵母中重组蛋白的诱导表达
        5、蛋白质的浓缩
        6、镍离子螯合层析柱纯化角蛋白酶
         7、 重组角蛋白酶酶学性质研究
1、2、3步都得到了满意的结果，可以说明目的基因片段已转进去，但是诱导表达没有酶活，诱导条件是：
        接种于5ml BMGY培养基，于30℃，250rpm摇床培养至OD600为2-6.0，离心收集菌体，转接到装有50ml BMMY培养基的500ml三角瓶中，相同培养条件继续培养，每24小时补加100％甲醇于培养基至终浓度为0.5%，诱导表达7天。
        第二天起每天取2ml样，离心，沉淀和上清分别保存于-20度冰箱留做测酶活和SDS-PAGE，确定最佳收获时间。
        大家看看有什么问题不，请求指教
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携手共创科技论坛
6楼2012-03-02 16:42:02
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cexoihtydx

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
adslye(金币+2): 感谢热心应助~祝顺利！ 2011-09-06 13:49:24
问2个问题：
1 对照组：空载酵母菌株同时诱导表达了吗?电泳的淡淡的目的条带是否是酵母的本底表达？
2 确定酶蛋白是分泌表达吗？否则，就需要超声破碎后，再测活性和跑蛋白胶。
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不放弃，日子总有阳光，追求总有希望！
2楼2011-09-05 21:02:08
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兔兔yy070330

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cexoihtydx at 2011-09-05 21:02:08:
问2个问题：
1 对照组：空载酵母菌株同时诱导表达了吗?电泳的淡淡的目的条带是否是酵母的本底表达？
2 确定酶蛋白是分泌表达吗？否则，就需要超声破碎后，再测活性和跑蛋白胶。

我做完电转后，用感受态细胞涂MD板，没有长。用线性化的pPIC9K空质粒分别电转GS115、KM71。相同条件下做了诱导表达，我的目的条带是和对照相比的，对照菌在60KD左右没有条带。另外，我的目的蛋白在原始菌中是分泌到胞外的，9K也是分泌表达的质粒。
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3楼2011-09-05 21:25:46
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soso327

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
adslye(金币+2): 感谢您的热心应助! 2011-09-06 13:49:58
很久没做毕赤酵母表达了，以前做过很长一段时间
当时也是电转后，甲醇诱导表达，但是表达时间都在一周以上；
因为菌体生长有个时期，我们一般取生长对数期到稳定期这个阶段的菌群提取蛋白。
还有就是你取样的时候是怎么取的，我们浓缩的时候都特别注意，因为蛋白很容易失活（我们当时好像用的硫酸铵？不太记得额）。希望对你分析有好处~~
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人生在于旅程，不在于结果！
4楼2011-09-06 10:18:15
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