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毕赤酵母表达的蛋白无活性
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各位大虾，我用毕赤酵母KM71和GS115表达我的目的基因（1.8K左右，是酶蛋白），培养5天，每天取样侧活，都没有活性，SDS-PAGE能看到微弱的条带。我是用电转的方法将SacⅠ线性化后的重组质粒导入酵母中的，提取酵母基因组做PCR，用AOX3'和AOX5'做引物，以及特异性引物都能扩出目的条带。现在老板催的紧，心理压力大呀。伤不起伤不起。跪求各位大虾给点建议。谢谢了 |
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 蛋白表达纯化与检测 |
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skpom
金虫 (小有名气)
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【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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从表达载体的构建到连接、转化、筛选、鉴定，现在开始用甲醇诱导，但是测酶活一直没有，跑SDS-PAGE在预计的片段位置有条带（因为外缘表达，蛋白含量低），因为没有合适的抗体不能做Western，蛋白有HIS标签，因为测不出酶活下面没法继续做。 1、转化子表型鉴定 2、采用G418浓度梯度筛选毕赤酵母高拷贝转化子 3、PCR验证毕赤酵母转化子 4、毕赤酵母中重组蛋白的诱导表达 5、蛋白质的浓缩 6、镍离子螯合层析柱纯化角蛋白酶 7、 重组角蛋白酶酶学性质研究 1、2、3步都得到了满意的结果，可以说明目的基因片段已转进去，但是诱导表达没有酶活，诱导条件是： 接种于5ml BMGY培养基，于30℃，250rpm摇床培养至OD600为2-6.0，离心收集菌体，转接到装有50ml BMMY培养基的500ml三角瓶中，相同培养条件继续培养，每24小时补加100％甲醇于培养基至终浓度为0.5%，诱导表达7天。 第二天起每天取2ml样，离心，沉淀和上清分别保存于-20度冰箱留做测酶活和SDS-PAGE，确定最佳收获时间。 大家看看有什么问题不，请求指教 |
6楼2012-03-02 16:42:02
cexoihtydx
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soso327
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4楼2011-09-06 10:18:15