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Atlantistree铁虫 (初入文坛)
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毕赤酵母表达时的杂蛋白问题 已有2人参与
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我最近构建毕赤酵母X-33工程菌表达干扰素（20KD左右），摇瓶用BMMY表达时，蛋白很纯，没有40KD以上的蛋白，但是上罐后用基础盐离子培养基发酵后杂蛋白很多；之前还做过甘露聚糖酶（47KD左右）的表达，用基础盐离子上罐发酵时，表达蛋白很纯，没有杂蛋白。甘露聚糖酶和干扰素所用的穿梭质粒和毕赤酵母菌种完全相同，发酵工艺也相同。搞不清楚表达干扰素时，为何摇瓶表达没有杂蛋白，但是上罐后杂蛋白很多，而上罐表达甘露聚糖酶时，相同的发酵工艺，却没有杂蛋白，这种现象是由于菌体死亡造成的，还是和表达的蛋白有关？如果由于菌体自溶造成的，如何调整发酵工艺啊？求大神指点！ 附上蛋白电泳图，一张是干扰素的发酵罐表达，一张是甘露聚糖酶的发酵罐表达。  干扰素发酵罐表达.jpg  甘露聚糖酶发酵罐表达.jpg |
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2楼2014-01-22 21:21:09
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3楼2014-01-23 08:29:01
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是直接上的发酵上清跑的电泳；质粒用的是PICZαA；发酵过程大概是上罐后36~42小时左右甘油补料长生物量，之后是甲醇诱导，甲醇补料速度先慢后快，根据溶氧控制补料速度，溶氧控制在30%左右。干扰素序列中有一个潜在糖基化位点，但糖基化对蛋白分子量的影响应该不会特别大吧。上面干扰素电泳图中，40KD以上的都是杂蛋白，不同的泳道是不同发酵时间取的样品。干扰素这个菌种我也上过很多次罐了，都有杂蛋白，估计这杂蛋白很有可能是菌体死亡后产生的，但是发酵工艺与甘露聚糖酶的大致相同，不知为何会出现这种状况。你说的酶活性和干扰素活性都能检测出来，但是干扰素有杂蛋白，使后面的纯化还要过离子交换柱什么的，就比较麻烦。 |
6楼2014-02-02 16:04:39
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蛋白在菌体内折叠修饰是耗氧过程，溶氧不足会影响蛋白活性，这个我在做甘露聚糖酶发酵时溶氧是否充足活性变化很明显，而且看很多文献基本上都把溶氧控制在20%-50%。在补料过程中通富氧空气，蠕动泵一工作补甲醇，溶氧就开始下降，当溶氧升到50%左右时开始下一次补料，这个过程时间不是很长，会因为碳源不够造成菌体死亡么？ 开始诱导后发酵液的OD值我倒是没测过，我是用湿菌重来衡量，湿菌重达到200 mg/mL左右时开始诱导，诱导期生物量也在增长，但比较缓慢，最后能达到湿菌重350 mg/mL左右。是不是在诱导阶段控制生物量维持恒定会比较好？估计杂蛋白是菌体死亡裂解出来的，很多文献里酵母表达的蛋白电泳图中都含有40KD以上的杂蛋白，这或许是种普遍现象？像我做的甘露聚糖酶这种杂蛋白很少的情况可能比较特殊，就是搞不明白是怎么造成的…… 太客气了，还没感谢你参与讨论呢…… |
8楼2014-02-11 11:31:40
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