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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 毕赤酵母表达时的杂蛋白问题
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Atlantistree

铁虫 (初入文坛)

[求助] 毕赤酵母表达时的杂蛋白问题 已有2人参与

我最近构建毕赤酵母X-33工程菌表达干扰素（20KD左右），摇瓶用BMMY表达时，蛋白很纯，没有40KD以上的蛋白，但是上罐后用基础盐离子培养基发酵后杂蛋白很多；之前还做过甘露聚糖酶（47KD左右）的表达，用基础盐离子上罐发酵时，表达蛋白很纯，没有杂蛋白。甘露聚糖酶和干扰素所用的穿梭质粒和毕赤酵母菌种完全相同，发酵工艺也相同。搞不清楚表达干扰素时，为何摇瓶表达没有杂蛋白，但是上罐后杂蛋白很多，而上罐表达甘露聚糖酶时，相同的发酵工艺，却没有杂蛋白，这种现象是由于菌体死亡造成的，还是和表达的蛋白有关？如果由于菌体自溶造成的，如何调整发酵工艺啊？求大神指点！
附上蛋白电泳图，一张是干扰素的发酵罐表达，一张是甘露聚糖酶的发酵罐表达。
毕赤酵母表达时的杂蛋白问题
干扰素发酵罐表达.jpg


毕赤酵母表达时的杂蛋白问题-1
甘露聚糖酶发酵罐表达.jpg
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上善若水
1楼 2014-01-22 11:31:19
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Atlantistree

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lcat at 2014-01-22 21:21:09
是干扰素蛋白产量低吗？干扰素和甘露聚糖酶这两张电泳图，发酵液上样体积是一样的吗？

嗯，干扰素产量是比较低。上样量不一样，甘露聚糖酶的上样量大概有5微吧，这是好早之前做的图。近期做过一次甘露聚糖酶的发酵上样量20微，与干扰素的上样量相同，但还是没有杂蛋白，我就很纠结……
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上善若水
3楼2014-01-23 08:29:01
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lcat

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Atlantistree: 金币+5, ★有帮助, 感谢帮助 2014-01-23 10:36:18
是干扰素蛋白产量低吗？干扰素和甘露聚糖酶这两张电泳图，发酵液上样体积是一样的吗？
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2楼2014-01-22 21:21:09
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

看你的描述和电泳图，都是胞外表达，直接发酵液上清上样是吧？组成型还是诱导型表达？用的BMMY和盐培养基，应该是诱导型，需要看你的质粒图谱（标明各元件即可）还有发酵大体步骤。

初步推断：毕赤酵母表达外源蛋白时，会有不同程度的糖基化现象，上罐进行高密度发酵的糖基化现象肯定比摇瓶要明显很多。另外，你的产物电泳显示有杂蛋白，建议进行2个实验，western blot和酶活测试。

还有毕赤酵母的上罐可能不能较频繁，所以建议多做几罐比较下结果。

上述5个问题的情况能够详细描述的话，问题应该能够确定。
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4楼2014-01-26 12:14:39
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

还有建议，如果真的是讨论问题还是要尽可能的把问题说清楚，最基本的把电泳图说清楚吧。不要忽略细节。我们做实验，任何一张正常有意义有结果的电泳图都要以发表文章的要求进行标识、说明和处理。
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5楼2014-01-26 12:17:40
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