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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 外源蛋白在毕赤酵母中不表达
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runying36

银虫 (正式写手)

[求助] 外源蛋白在毕赤酵母中不表达

有哪位热心的战友给提示一下，我的外源蛋白在毕赤酵母中不表达，实验室同期做得都有表达，说明系统没有问题，但我的为什么没表达？有么有实战经验，一般这种情况先从哪方面试比较靠谱？
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1楼 2013-11-04 16:58:21
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runying36

银虫 (正式写手)
谢谢楼上各位的热心回应，我今天很高兴地告诉大家我已经优化出来了，其实就是改变了一下pH值从7.4降下来的几个看来都有效果。谢谢了！
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7楼2013-11-05 11:32:30
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runying36

银虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by luyongchao at 2013-11-06 15:51:04
表达量太低，应该纯化不出来吧!...

如果实在是要纯化出蛋白，只要检测到有存在，还是可以想办法优化的，这只有自己试试看了
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11楼2013-11-06 21:53:15
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runying36

银虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by luyongchao at 2013-11-06 15:51:04
表达量太低，应该纯化不出来吧!...

如果单因素的条件不能改变状况，可以试试用正交分析多因素的作用，祝好运
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12楼2013-11-06 21:55:03
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runying36

银虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 省心小姐 at 2014-09-17 15:21:46
具体甲醇的量应该加多少？过多会导致什么结果？...

甲醇量没优化过奥，就是0.5%
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17楼2014-09-18 06:45:34
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xiaopeiliang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
runying36: 金币+1, ★有帮助, 做了WB没检测到信号 2013-11-05 01:02:21
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-05 12:41:56
不表达还是表达量低，有没有做WB检测下；
如果是不表达：考虑目的基因有没有启动子；再就是考虑重组转化的问题了。
如果表达量低：可能是基因序列不适合毕赤酵母表达体系，可以考虑优化密码子；  或者体内体外构建多拷贝增加表达量，发酵条件的筛选也可以尝试
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2楼2013-11-04 21:48:47
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anyaxiong

铁杆木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
runying36: 金币+1, ★有帮助, 做了WB没检测到信号，这样不知道优化这些方面会不会有实质性改变 2013-11-05 01:03:05
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-05 12:42:03
酵母表达影响因素很多：比较重要的考虑甲醇的量，诱导温度，诱导时间，接种量和酸碱度等，还有就是你的蛋白可能表达了，只是检测方法不当也不无可能，有标签的蛋白建议做WB；还有酵母表达有糖基化修饰，会导致实际蛋白大小比理论值要大一些。
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爱拼才会赢
3楼2013-11-04 21:50:49
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anyaxiong

铁杆木虫 (知名作家)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xiaopeiliang at 2013-11-04 21:48:47
不表达还是表达量低，有没有做WB检测下；
如果是不表达：考虑目的基因有没有启动子；再就是考虑重组转化的问题了。
如果表达量低：可能是基因序列不适合毕赤酵母表达体系，可以考虑优化密码子；  或者体内体外构建 ...

拷贝数的增加并不一定能增加蛋白表达量，只是理论上有可能而已。
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爱拼才会赢
4楼2013-11-04 21:52:36
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xiaopeiliang

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by anyaxiong at 2013-11-04 21:52:36
拷贝数的增加并不一定能增加蛋白表达量，只是理论上有可能而已。...

不止理论，实际上也很多，呵呵
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5楼2013-11-04 22:55:06
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yuhuaing

新虫 (初入文坛)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-05 12:42:13
毕赤酵母表达系统是一个高表达系统，但他的缺陷之一就是其在高表达目的蛋白的同时会高表达蛋白酶，所以，有可能不是你的目的蛋白未表达而是你的目标蛋白被讲解了。解决的办法就是可以在培养基中适当加入过量的氨基酸或者调解培养基的pH. 一点点建议，希望对你有用，祝实验顺利！
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6楼2013-11-04 23:35:42
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luyongchao

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by runying36 at 2013-11-05 11:32:30
谢谢楼上各位的热心回应，我今天很高兴地告诉大家我已经优化出来了，其实就是改变了一下pH值从7.4降下来的几个看来都有效果。谢谢了！

电泳能看到条带吗，我的表达量也很低，只是WB的结果，他们说的方法我们都试过了，还是很低啊，怎么办怎么办！
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8楼2013-11-05 11:42:14
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runying36

银虫 (正式写手)
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8楼: Originally posted by luyongchao at 2013-11-05 11:42:14
电泳能看到条带吗，我的表达量也很低，只是WB的结果，他们说的方法我们都试过了，还是很低啊，怎么办怎么办！...

我目前也只是用WB检测出来的，但根据我们实验室的经验，曝光1分钟的阳性克隆就可以纯化出重组蛋白。我觉得你可以先不管SDS-page的结果，如果是需要重组蛋白就先纯化，如果只是拿粗提液做实验就直接做，不要浪费精力在不停地提高产量上。
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9楼2013-11-05 15:48:29
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luyongchao

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by runying36 at 2013-11-05 15:48:29
我目前也只是用WB检测出来的，但根据我们实验室的经验，曝光1分钟的阳性克隆就可以纯化出重组蛋白。我觉得你可以先不管SDS-page的结果，如果是需要重组蛋白就先纯化，如果只是拿粗提液做实验就直接做，不要浪费精力 ...

表达量太低，应该纯化不出来吧!
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10楼2013-11-06 15:51:04
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