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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 毕赤酵母表达问题求教
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liyouran85

金虫 (小有名气)

[求助] 毕赤酵母表达问题求教

使用载体pPIC9K整合表达，基因来源于细菌，根据序列预测的分子量为100 kDa左右，可是表达出来的蛋白大小在70 kDa左右，且不具备酶活，请问有可能哪些地方出现了问题？谢谢
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1楼 2012-05-02 21:29:48
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回帖置顶 ( 共有1个 )

post_ngao

木虫 (正式写手)

科研宅

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
silicare: 金币+50, BioEPI+1, 楼主奖励 2012-05-03 15:43:32
第一，细菌来源的蛋白为什么要用酵母表达？原核蛋白用E coli就可以了啊。
第二，就算你要用毕赤酵母表达，那么你的原核来源基因是否经过优化？因为毕赤酵母中是存在非通用密码子的。
第三，分子量变小，第一时间必须果断测序，仔细检查是否存在移码突变、点突变等的问题，还必须考虑非通用密码子的问题。
第四，没有酶活力，除了序列的问题，我个人感觉还有使用毕赤酵母的原因。因为用酵母最多的就是在利用它的糖基化能力，而毕赤酵母的过糖基化是出了名的，并且N、O糖基化位点很难预测。你的蛋白是原核来源的，它在行使催化功能的时候是不需要糖基化的，如果给它强加入糖基化非常有可能堵住底物通道或者使得cap有位阻打不开，就属于多此一举了。
第五，同一个蛋白序列，用E coli和酵母分别表达时，其最终的折叠状态也是不同的，这也可能是没有活力的原因之一。

所知信息不多，只能大致说说，具体情况还得具体分析。有需要可以联系我。
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天命所归，各安其位
3楼2012-05-03 10:16:36
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post_ngao

木虫 (正式写手)

科研宅
原始的毕赤酵母确实存在着蛋白酶，不过现在一般的工程菌都是蛋白酶敲除型的，你可以在网上查一下你的毕赤酵母的型号，比如GS-115等，就可以知道是否为蛋白酶敲除型的了。

另外我看你用的质粒是pPICZ9K，9K可以跨膜吗？貌似上面没有α-factor 的信号肽吧？没有的话就不会跨膜。如果你一定怀疑是蛋白酶的话，可以在培养基中加入蛋白酶抑制剂，比如最常用的PMSF. 我也曾经尝试过，对表达量影响不大，可以试一下。

PMSF：1)10mg/ml溶于异丙醇中; 在室温下可保存一年;
　　    2)工作浓度:17~174ug/ml(0.1~1.0mmol/L);
　　    3)在水液体溶液中不稳定，必须在每一次分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF。
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天命所归，各安其位
8楼2012-05-03 20:38:58
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普通回帖

nemo88

禁虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liyouran85: 金币+50, ★有帮助, 5 2012-05-03 15:37:43
silicare: 金币-45, 楼主操作失误，补偿5个金币 2012-05-03 15:44:45
本帖内容被屏蔽
2楼2012-05-02 23:17:49
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liyouran85

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by post_ngao at 2012-05-03 10:16:36:
第一，细菌来源的蛋白为什么要用酵母表达？原核蛋白用E coli就可以了啊。
第二，就算你要用毕赤酵母表达，那么你的原核来源基因是否经过优化？因为毕赤酵母中是存在非通用密码子的。
第三，分子量变小，第一时间 ...

谢谢您的详细分析，构建的重组质粒连入的基因部分已经过测序，证明无误；由于分子量变小，个人猜测是不是有可能是跨膜时肽酶的切割所致，因为看到过毕赤酵母中肽酶的相关报道，请问您了解这方面吗？如果是这样的问题，该如何处理？谢谢！
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4楼2012-05-03 16:05:09
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liyouran85

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by post_ngao at 2012-05-03 10:16:36:
第一，细菌来源的蛋白为什么要用酵母表达？原核蛋白用E coli就可以了啊。
第二，就算你要用毕赤酵母表达，那么你的原核来源基因是否经过优化？因为毕赤酵母中是存在非通用密码子的。
第三，分子量变小，第一时间 ...

我觉得首先要解决的问题就是为何表达出了分子量变小的蛋白。
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5楼2012-05-03 16:06:39
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danbomingyue

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
6楼2012-05-03 16:53:01
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danbomingyue

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
7楼2012-05-03 16:57:37
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feilinshiji

银虫 (小有名气)
原核蛋白为什么要用酵母表达？？？原核蛋白在真核表达系统中有活性吗？？？目的基因有没有突变导致提前终止？
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9楼2012-05-04 00:25:58
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wurenzhi0721

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by post_ngao at 2012-05-03 20:38:58
原始的毕赤酵母确实存在着蛋白酶，不过现在一般的工程菌都是蛋白酶敲除型的，你可以在网上查一下你的毕赤酵母的型号，比如GS-115等，就可以知道是否为蛋白酶敲除型的了。

另外我看你用的质粒是pPICZ9K，9K可以跨 ...

好厉害啊
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你快乐所以我快乐，我快乐所以大家也快乐
10楼2012-08-14 22:50:13
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