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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于毕赤酵母电转化
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dhmdddd

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】关于毕赤酵母电转化

请教各位大虾，本人现在在做毕赤酵母的电转化，想问一下：
（1）大家线性化的质粒都加多少啊？我一般都加20微，回收后跑胶也挺亮的，量挺大的，我们的电转杯是400微的，当时买的时候没有注意，现在酵母加进去就有200多微吧，这样子。
（2）电转化后大家是静止培养还是慢摇培养啊？问的别人也是说什么的都有……
（3）最最郁闷的就是后培养后的涂布，我们这边用的都是6cm的小平板，G418浓度时1mg/mL，第一次的时候就是离心全部涂布，然后板上面全部长满，当然有一个师兄说这个是“尸体”以前实验室也没有人做酵母，没有所谓的经验。后来又买了新的G418，做了抗性检验，涂布空的GS115也是长满，这个汗啊，但是没有单菌落，问了别人，也有人说是有菌的，但是转化子是能长出来单菌落的……
码了好多字，大家帮忙看看吧先谢过了！！
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1楼2010-12-07 10:45:32
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lq8609019558

新虫 (初入文坛)
dhmdddd(金币+1):恩，知道了，谢谢！ 2010-12-08 08:30:04
我们一般都是10微升线化质粒（5-10微克）加80微升感受态细胞混匀，静止一小时，涂平板时，应该按不同菌量涂在几个板子上。 你的平板上铺满了菌，没有单科，怀疑是不是你的抗性不够，或是抗性失活了。倒平板时，温度降到60左右，再加抗生素，混匀，倒平板
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8楼2010-12-07 22:34:19
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xiaopeiliang

金虫 (小有名气)
dhmdddd(金币+1):因为我是要高表达的菌株，所以用了G418，你的MM培养基是什么啊？没有用过…… 2010-12-07 11:51:23
线性化的质粒20ul应该算是够了，要求是在5-10ug，只要是是跑胶很亮应该是不成问题，话说回来，质粒量不够，几率还是有的
电转后要慢慢摇，英语说的gentel shake，至于到底多少转，只能自己摸索了
至于G148这个问题，我没有用过，我是用的Bgl线性化的，用MD和MM筛选，最后做PCR克隆来鉴定阳性克隆的
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2楼2010-12-07 11:09:30
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旋木晴晴

金虫 (小有名气)
dhmdddd(金币+1):不要离心的是吧？ 2010-12-07 13:02:33
电转后静置放置。电转一次可以涂几块板
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3楼2010-12-07 12:46:16
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dhmdddd

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 旋木晴晴 at 2010-12-07 12:46:16:
电转后静置放置。电转一次可以涂几块板

恩，又一次也是涂布量也比较少，结果后来还是长满了，就是平铺，也没有见单菌落……
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4楼2010-12-07 13:26:19
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xiaopeiliang

金虫 (小有名气)
dhmdddd(金币+1):知道了，谢谢！ 2010-12-07 14:11:17
引用回帖:
Originally posted by dhmdddd at 2010-12-07 10:45:32:
请教各位大虾，本人现在在做毕赤酵母的电转化，想问一下：
（1）大家线性化的质粒都加多少啊？我一般都加20微，回收后跑胶也挺亮的，量挺大的，我们的电转杯是400微的，当时买的时候没有注意，现在酵母加 ...

把10成葡萄糖换成10成甲醇就是MM了
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5楼2010-12-07 13:53:42
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
什么载体，什么菌啊

PPIC9K好像要用营养缺陷和抗性双筛选才能出单菌落的
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6楼2010-12-07 16:11:35
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dhmdddd

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by zhaocy8903 at 2010-12-07 16:11:35:
什么载体，什么菌啊

PPIC9K好像要用营养缺陷和抗性双筛选才能出单菌落的

PPIC9K线性化后转化GS115菌株
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7楼2010-12-07 16:18:28
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墨香若水

木虫 (著名写手)
加点Zeosin
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9楼2010-12-07 23:35:04
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墨香若水

木虫 (著名写手)
dhmdddd(金币+1):恩，后来的就不离心了！ 2010-12-08 08:32:23
引用回帖:
Originally posted by 旋木晴晴 at 2010-12-07 12:46:16:
电转后静置放置。电转一次可以涂几块板

不要离心~~
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10楼2010-12-07 23:35:37
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dhmdddd

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 墨香若水 at 2010-12-07 23:35:04:
加点Zeosin

那会不会有毕赤酵母GS115不是组氨酸缺陷型的啊？
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11楼2010-12-08 08:31:26
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
把你的GS115涂个MD平板看看
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12楼2010-12-08 08:35:33
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dhmdddd

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by zhaocy8903 at 2010-12-08 08:35:33:
把你的GS115涂个MD平板看看

一直都是用的MD平板，山梨醇融葡萄糖，然后倒板的时候再加YNB，生物素和G418的
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13楼2010-12-08 08:39:37
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
dhmdddd(金币+1):恩！ 2010-12-08 08:51:17
我说的是转化前的空菌，看看是否还是营养缺陷菌
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14楼2010-12-08 08:40:52
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dhmdddd

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by zhaocy8903 at 2010-12-08 08:40:52:
我说的是转化前的空菌，看看是否还是营养缺陷菌

我用空菌GS115涂布了，结果也是长满了，但是没有单菌落，是不是本身这个菌就不是组氨酸缺陷型的，有这个可能吗？记得当时师兄给我菌的时候叨叨了一句，因为这个菌也是别人给的……
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15楼2010-12-08 08:53:06
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pidou213

木虫 (正式写手)
dhmdddd(金币+1):是啊，涂布量是挺大的，呵呵，在改，在改^-^ 2010-12-08 10:14:17
如果是一片“尸体”，无单克隆菌落的话，我只能说你涂布平板时的菌液量浓度太大了
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16楼2010-12-08 09:57:59
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啊Q精神

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
dhmdddd: 金币+2 2012-08-30 21:43:30
我都没有摇过，电完之后直接涂板
操作手册上是80u酵母加20u线性质粒。电完用1ml山梨醇洗出，然后每200ul-500ul涂一块MD板
涂抗生素G418板的话，菌不能太浓，涂10的5次方的细胞吧大概（1OD为5乘10的7次方个细胞）
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17楼2012-08-30 14:11:37
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lymic07

禁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
18楼2013-09-11 12:00:53
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乐云蓝

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
2楼: Originally posted by xiaopeiliang at 2010-12-07 11:09:30
线性化的质粒20ul应该算是够了，要求是在5-10ug，只要是是跑胶很亮应该是不成问题，话说回来，质粒量不够，几率还是有的
电转后要慢慢摇，英语说的gentel shake，至于到底多少转，只能自己摸索了
至于G148这个问题 ...

我也是用MD和MM筛选的，可是做PCR克隆都没有啊，请问 PCR程序怎样设置的
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19楼2014-09-17 10:04:54
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wangsongwei

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
您好，最近我在转化酵母做抗性筛选时也遇到了相关问题。我的线性化片段带有G418抗性基因，转化毕赤酵母X-33后，做G418抗性筛选，0.3mg/ml筛选，做了几次 也是长满平板。是抗性浓度不合适？还是？当时您是怎么解决这个问题的呢？谢谢，谢谢，谢谢
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20楼2014-10-29 19:22:32
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dhmdddd

木虫 (正式写手)
引用回帖:
20楼: Originally posted by wangsongwei at 2014-10-29 19:22:32
您好，最近我在转化酵母做抗性筛选时也遇到了相关问题。我的线性化片段带有G418抗性基因，转化毕赤酵母X-33后，做G418抗性筛选，0.3mg/ml筛选，做了几次 也是长满平板。是抗性浓度不合适？还是？当时您是怎么解决这 ...

这个还是在学校的时候做的，不太记得了。。不好意思。。

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21楼2014-10-29 22:59:24
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dhmdddd

木虫 (正式写手)
引用回帖:
20楼: Originally posted by wangsongwei at 2014-10-29 19:22:32
您好，最近我在转化酵母做抗性筛选时也遇到了相关问题。我的线性化片段带有G418抗性基因，转化毕赤酵母X-33后，做G418抗性筛选，0.3mg/ml筛选，做了几次 也是长满平板。是抗性浓度不合适？还是？当时您是怎么解决这 ...

为什么你的片段有G418抗性？空菌有木有问题？还有试试涂布的量少一点看看，没有帮到你抱歉。。

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22楼2014-10-29 23:01:30
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wangsongwei

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
22楼: Originally posted by dhmdddd at 2014-10-29 23:01:30
为什么你的片段有G418抗性？空菌有木有问题？还有试试涂布的量少一点看看，没有帮到你抱歉。。
...

我的外源片段是含有G418抗性基因的，常理来说只有导入外源片段的菌株才有抗性。您用过的抗性浓度是多少呢？
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23楼2014-10-30 10:20:14
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