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dhmdddd

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】关于毕赤酵母电转化

请教各位大虾，本人现在在做毕赤酵母的电转化，想问一下：
（1）大家线性化的质粒都加多少啊？我一般都加20微，回收后跑胶也挺亮的，量挺大的，我们的电转杯是400微的，当时买的时候没有注意，

现在酵母加进去就有200多微吧，这样子。
（2）电转化后大家是静止培养还是慢摇培养啊？问的别人也是说什么的都有……
（3）最最郁闷的就是后培养后的涂布，我们这边用的都是6cm的小平板，G418浓度时1mg/mL，第一次的时候就是离心全部涂布，然后板上面全部长满，当然有一个师兄说这个是“尸体”

以前实验室也没有人做酵母，没有所谓的经验。后来又买了新的G418，做了抗性检验，涂布空的GS115也是长满，这个汗啊，但是没有单菌落，问了别人，也有人说是有菌的，但是转化子是能长出来单菌落的……
码了好多字，大家帮忙看看吧先谢过了！！

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1楼2010-12-07 10:45:32

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dhmdddd

木虫 (正式写手)

引用回帖:

20楼: Originally posted by wangsongwei at 2014-10-29 19:22:32
您好，最近我在转化酵母做抗性筛选时也遇到了相关问题。我的线性化片段带有G418抗性基因，转化毕赤酵母X-33后，做G418抗性筛选，0.3mg/ml筛选，做了几次也是长满平板。是抗性浓度不合适？还是？当时您是怎么解决这 ...

为什么你的片段有G418抗性？空菌有木有问题？还有试试涂布的量少一点看看，没有帮到你抱歉。。

[ 发自小木虫客户端 ]

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22楼2014-10-29 23:01:30

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xiaopeiliang

金虫 (小有名气)

应助: 21 (小学生)
金币: 349.1
帖子: 151
在线: 70.4小时
虫号: 1044898

dhmdddd(金币+1):因为我是要高表达的菌株，所以用了G418，你的MM培养基是什么啊？没有用过…… 2010-12-07 11:51:23

线性化的质粒20ul应该算是够了，要求是在5-10ug，只要是是跑胶很亮应该是不成问题，话说回来，质粒量不够，几率还是有的
电转后要慢慢摇，英语说的gentel shake，至于到底多少转，只能自己摸索了
至于G148这个问题，我没有用过，我是用的Bgl线性化的，用MD和MM筛选，最后做PCR克隆来鉴定阳性克隆的

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2楼2010-12-07 11:09:30

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