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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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dhmdddd

木虫 (正式写手)


[交流] 【求助/交流】关于毕赤酵母电转化

请教各位大虾,本人现在在做毕赤酵母的电转化,想问一下:
(1)大家线性化的质粒都加多少啊?我一般都加20微,回收后跑胶也挺亮的,量挺大的,我们的电转杯是400微的,当时买的时候没有注意,现在酵母加进去就有200多微吧,这样子。
(2)电转化后大家是静止培养还是慢摇培养啊?问的别人也是说什么的都有……
(3)最最郁闷的就是后培养后的涂布,我们这边用的都是6cm的小平板,G418浓度时1mg/mL,第一次的时候就是离心全部涂布,然后板上面全部长满,当然有一个师兄说这个是“尸体”以前实验室也没有人做酵母,没有所谓的经验。后来又买了新的G418,做了抗性检验,涂布空的GS115也是长满,这个汗啊,但是没有单菌落,问了别人,也有人说是有菌的,但是转化子是能长出来单菌落的……
码了好多字,大家帮忙看看吧先谢过了!!
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旋木晴晴

金虫 (小有名气)


dhmdddd(金币+1):不要离心的是吧? 2010-12-07 13:02:33
电转后静置放置。电转一次可以涂几块板
3楼2010-12-07 12:46:16
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xiaopeiliang

金虫 (小有名气)


dhmdddd(金币+1):因为我是要高表达的菌株,所以用了G418,你的MM培养基是什么啊?没有用过…… 2010-12-07 11:51:23
线性化的质粒20ul应该算是够了,要求是在5-10ug,只要是是跑胶很亮应该是不成问题,话说回来,质粒量不够,几率还是有的
电转后要慢慢摇,英语说的gentel shake,至于到底多少转,只能自己摸索了
至于G148这个问题,我没有用过,我是用的Bgl线性化的,用MD和MM筛选,最后做PCR克隆来鉴定阳性克隆的
2楼2010-12-07 11:09:30
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dhmdddd

木虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by 旋木晴晴 at 2010-12-07 12:46:16:
电转后静置放置。电转一次可以涂几块板

恩,又一次也是涂布量也比较少,结果后来还是长满了,就是平铺,也没有见单菌落……
4楼2010-12-07 13:26:19
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xiaopeiliang

金虫 (小有名气)


dhmdddd(金币+1):知道了,谢谢! 2010-12-07 14:11:17
引用回帖:
Originally posted by dhmdddd at 2010-12-07 10:45:32:
请教各位大虾,本人现在在做毕赤酵母的电转化,想问一下:
(1)大家线性化的质粒都加多少啊?我一般都加20微,回收后跑胶也挺亮的,量挺大的,我们的电转杯是400微的,当时买的时候没有注意,现在酵母加 ...

把10成葡萄糖换成10成甲醇就是MM了
5楼2010-12-07 13:53:42
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