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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于毕赤酵母pPICZaA载体
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XUMIN6891

金虫 (初入文坛)

[求助] 关于毕赤酵母pPICZaA载体

各位虫友你们好！我想请教一下有谁用pPICZaA这个载体？另外我还想知道这个载体要是选Xho I酶切位点时必须加上AAAAGA这个序列是吧，这样可以保证具有天然的N端，那如果我分析出来的我的已知的氨基酸序列用软件分析中间存在信号肽的话，那样是不是就不能做后期的克隆表达了，因为出现的信号肽不是一处我的这段氨基酸序列是重复的，所以出现好多峰值，我对信号肽这块不是太懂，想要请教一下！
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1楼 2012-05-17 21:48:18
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 专家考核, 辛苦 2012-05-18 15:37:07
1、用pPICZaA这个载体做分泌表达，选Xho I酶切位点时不止加上AAAAGA，还要长点，是AAAAGAGAGGCTGAAGCT，信号肽最终切割位点在Glu-Ala-Glu-Ala后面。
2、基因中存在的信号肽问题，你可以用不同的软件去分析下，一般说来信号肽存在蛋白的N端，很少在中间的。
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2楼2012-05-18 08:51:49
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XUMIN6891

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lxj341401 at 2012-05-18 08:51:49:
1、用pPICZaA这个载体做分泌表达，选Xho I酶切位点时不止加上AAAAGA，还要长点，是AAAAGAGAGGCTGAAGCT，信号肽最终切割位点在Glu-Ala-Glu-Ala后面。
2、基因中存在的信号肽问题，你可以用不同的软件去分析下，一 ...

谢谢你的回复，不过我还想问几个问题，我对这个选酶切位点时候对这个Xhol I和选其他的区别我不是很懂，我也可以不选Xhol I，比如选EcoR I或者其他多克隆位点，对吗，只不过选者Xhol I的话能保证天然的N端吗，选择其他就不能保证了吗？还有我的氨基酸序列是段重复序列，用软件分析时就会在中间出现信号肽，都会在同样的位置出现，这样的话我还能继续做后面的克隆表达吗？
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3楼2012-05-18 15:04:28
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜: 金币+2, 专家考核, Good！ 2012-05-18 18:51:46
引用回帖:
3楼: Originally posted by XUMIN6891 at 2012-05-18 15:04:28:
谢谢你的回复，不过我还想问几个问题，我对这个选酶切位点时候对这个Xhol I和选其他的区别我不是很懂，我也可以不选Xhol I，比如选EcoR I或者其他多克隆位点，对吗，只不过选者Xhol I的话能保证天然的N端吗，选择 ...

1、选者Xhol I的优点是能保证天然的N端，缺点是必须把信号肽切割位点的序列补全；选择其他酶切位点就N端多出氨基酸来了；
2、能不能做后续的克隆表达不好说，别人是否表达过该序列，如表达过，你自然能做后续的克隆表达，如果没有人做过，也不能说不能做，除非人家验证过不能做。其实，试验嘛，先看文献，没有文献佐证就自己试试。
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4楼2012-05-18 15:58:03
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XUMIN6891

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lxj341401 at 2012-05-18 15:58:03:
1、选者Xhol I的优点是能保证天然的N端，缺点是必须把信号肽切割位点的序列补全；选择其他酶切位点就N端多出氨基酸来了；
2、能不能做后续的克隆表达不好说，别人是否表达过该序列，如表达过，你自然能做后续的 ...

也就是说可以选择其他酶切位点，但是N端就多氨基酸了，然后最后算蛋白大小的时候，不用从载体上面那个起始密码子开始算吗，我看好多文献都直接从他插入基因那点算蛋白大小，这应该如何解释呢？
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5楼2012-05-18 22:17:07
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by XUMIN6891 at 2012-05-18 22:17:07:
也就是说可以选择其他酶切位点，但是N端就多氨基酸了，然后最后算蛋白大小的时候，不用从载体上面那个起始密码子开始算吗，我看好多文献都直接从他插入基因那点算蛋白大小，这应该如何解释呢？

信号肽会被切割的，所以不能从起始密码子开始算。
要看文献中用的是哪个酶切位点，如果离切割位点较近的酶切位点，那么直接从他插入基因那点算蛋白大小影响也不大，多几个氨基酸分子量也不会增加1kD，但准确分子量不是这么算的。
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XUMIN6891
6楼2012-05-19 06:46:23
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XUMIN6891

金虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by lxj341401 at 2012-05-19 06:46:23:
信号肽会被切割的，所以不能从起始密码子开始算。
要看文献中用的是哪个酶切位点，如果离切割位点较近的酶切位点，那么直接从他插入基因那点算蛋白大小影响也不大，多几个氨基酸分子量也不会增加1kD，但准确分子 ...

非常感谢你的回复！我现在用两种不同的分析软件分析我的已知氨基酸结果出现有的会显示有信号肽，有的就没有，我用的是signalp3.0和4.0的，结果4.0版本的分析出来就没有，3.0的就会有，这样的话我应该信哪个啊?你经常使用的哪个软件分析的啊？还有我请教一个老师，他说我那个本身是段有活性的目标蛋白，不用分析信号肽可以直接做表达，是这样吗？我不是很懂！请赐教！谢谢！
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7楼2012-05-19 11:47:04
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

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7楼: Originally posted by XUMIN6891 at 2012-05-19 11:47:04:
非常感谢你的回复！我现在用两种不同的分析软件分析我的已知氨基酸结果出现有的会显示有信号肽，有的就没有，我用的是signalp3.0和4.0的，结果4.0版本的分析出来就没有，3.0的就会有，这样的话我应该信哪个啊?你 ...

既然是段有活性的目标蛋白，那就直接做表达。
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8楼2012-05-19 11:59:38
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