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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 毕赤酵母电转化问题求助
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475502411

铜虫 (著名写手)

[求助] 毕赤酵母电转化问题求助

我的电转步骤如下，但不知道是否有问题，涂到MD板上两天了，也没有长出来，请各位大侠帮我看看，谢谢
1. 感受态的制备：过夜培养的OD =1.4，取25ml离心---用25ml冰浴灭菌水重悬离心---用12.5ml冰浴灭菌水重悬离心----用2ml冰浴1M山梨醇重悬离心-------用500微升1M山梨醇重悬80微升分装----负80备用
2.质粒线性化：测序正确的质粒用SacI每期峨眉线性化------DNA直接回收试剂盒回收------用BAP去磷酸化试剂盒去磷酸化-------跑胶回收，用25微升TE洗脱，浓度大约为30ng/ul
3.电转化：用伯乐的电转移，按照仪器自身的毕赤酵母的电转参数进行，用的0.2的电转杯
4.电转后30℃静置1-2h，取200ul涂板；还有两个是把电转液1500g离心30s弃上清，沉淀混匀涂板

但两天了都没有东西长出来，不知道是不是哪儿出问题了，请指教
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1楼 2012-09-15 10:39:27
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回帖置顶 ( 共有1个 )

reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
475502411: 金币+10 2012-09-17 17:02:40
1949stone: 回帖置顶 2012-09-17 17:24:13
1949stone: MolEPI+1, 热情啊 2012-09-17 17:25:15
你的感受态等于是只用山梨醇处理了，这样效果不好。我在资源帖上分享了毕赤酵母现做现用感受态和长期保存感受态的制备方法。转化效率都非常好。建议你去看看然后试试。

你的菌OD值才1.4，只离心了25mL，菌量太少了，感受态不要做的菌量太低。

另外，质粒线性化后不用去磷酸化，都是线性化产物直接转毕赤酵母的。

电转后要加500--1000uL的冰预冷1 M山梨醇后再复苏，如果涂MD板是不用复苏的，涂抗性板需要摇床复苏1 h后再涂板。

涂板200uL太少了点，本来菌少转化效率也低，就要多涂。

仅为交流。
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7楼2012-09-17 16:18:14
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小丹木木

荣誉版主 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
475502411: 金币+5 2012-09-17 17:02:45
线性化后就直接电转了哦
没有去磷酸化哦
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6楼2012-09-17 13:53:42
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jane晨宝儿

铜虫 (初入文坛)
我觉得有可能是你转化用的质粒浓度太低，之前我做的时候也是没有转化出来，后来在线性化这一步，我做了大体系，取一小部分跑胶，确定切开之后，用剩下的直接电转，没有进行回收这一步，因为我觉得回收后，浓度太低，不利于转化。反正我就是这样转化成功了，希望能对你有帮助~~
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26楼2012-12-09 22:49:55
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reallpf

木虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 475502411 at 2012-09-18 14:27:48
谢谢，好的，这是我的操作步骤，你看有问题吗？
感受态的制备：过夜培养的OD =1.4，取100ml离心---用25ml冰浴灭菌水重悬离心---用12.5ml冰浴灭菌水重悬离心----用2ml冰浴1M山梨醇重悬离心-------用300微升1M山梨醇 ...

个人觉得你的步骤没有什么变化。由于酵母的细胞壁是很厚的，感受态的制备过程中只有山梨醇处理没有什么效果。建议你用http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=4760057长期感受态制备方法。另外电转的参数都是一样的，任何一篇关于毕赤酵母学位论文都有。
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475502411 475502411
15楼2012-09-18 21:42:56
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普通回帖

xiaodao1

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
475502411: 金币+5 2012-09-16 09:52:13
你第一步重悬用的山梨醇用量太多，而且感受态放-80度后转化率会降低，最好现做现用。
还有可能会3天才出来转化子啊。
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475502411
2楼2012-09-15 20:44:10
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475502411

铜虫 (著名写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by xiaodao1 at 2012-09-15 20:44:10
你第一步重悬用的山梨醇用量太多，而且感受态放-80度后转化率会降低，最好现做现用。
还有可能会3天才出来转化子啊。

这样啊，那以后我就现做现用
那第一步的山梨醇重悬用多少比较合适啊？
我的线性化有问题吗？
谢谢
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3楼2012-09-16 09:52:06
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xiaodao1

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 475502411 at 2012-09-16 09:52:06
这样啊，那以后我就现做现用
那第一步的山梨醇重悬用多少比较合适啊？
我的线性化有问题吗？
谢谢...

我线性化后一般直接做了胶回收，用尽量少的无菌水洗脱，让质粒尽量弄。另外加山梨醇重悬的时候，没有具体的量，一般100mL的菌液做的感受态细胞，最后我是加200-400uL重悬，而且根据具体情况，尽量少加，让感受态细胞尽量越浓越好。
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475502411
4楼2012-09-16 22:51:59
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475502411

铜虫 (著名写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by xiaodao1 at 2012-09-16 22:51:59
我线性化后一般直接做了胶回收，用尽量少的无菌水洗脱，让质粒尽量弄。另外加山梨醇重悬的时候，没有具体的量，一般100mL的菌液做的感受态细胞，最后我是加200-400uL重悬，而且根据具体情况，尽量少加，让感受态细 ...

我转化的菌长出来了，但是很小，根本没有办法挑起来，就好像针尖一样，并且铺的慢慢一层，有的地方没有涂开就是一团一团的，怎么办？他们会是转化子吗？谢谢
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5楼2012-09-17 09:09:49
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475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by reallpf at 2012-09-17 16:18:14
你的感受态等于是只用山梨醇处理了，这样效果不好。我在资源帖上分享了毕赤酵母现做现用感受态和长期保存感受态的制备方法。转化效率都非常好。建议你去看看然后试试。

你的菌OD值才1.4，只离心了25mL，菌量太少 ...

谢谢，我初做看大家是这么说的
我请问一下，我用的是GS115，PIC3.5K，SacI线性化的，但不知道是否有问题，涂到MD板上3-4天了，长得跟针尖一样很小很小，不用力看都看不见，并且没有涂开的部分是一片一片的，连单个小菌落也没有，我都怀疑是不是克隆子，但应该是酵母，因为是酵母的味道。
涂板的时候取200ul涂板；还有两个是把转化后的全部菌1500g离心30s弃上清，沉淀混匀涂板

现在实在没有办法往下进展，因为我重复一次还是这样的，今天我把长出来的那些东西用YPD培养基冲洗下来分别涂了不同浓度的G418的YPD板和空白的YPD板，以及MD板，想看看能不能长出来

希望您能给我分析一下，往下怎么做？
谢谢
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8楼2012-09-17 17:00:34
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reallpf

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 475502411 at 2012-09-17 17:00:34
谢谢，我初做看大家是这么说的
我请问一下，我用的是GS115，PIC3.5K，SacI线性化的，但不知道是否有问题，涂到MD板上3-4天了，长得跟针尖一样很小很小，不用力看都看不见，并且没有涂开的部分是一片一片的，连单个 ...

线性化完了先跑电泳检测下是否线性化完全和大小是否正确。
涂板后3-4天长出来比较少见，但也正常。
涂板时要涂到都被培养基吸收才行，所以出现一小片白的也是正常的。
重新做批感受态再转吧。
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9楼2012-09-18 09:22:21
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475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by reallpf at 2012-09-18 09:22:21
线性化完了先跑电泳检测下是否线性化完全和大小是否正确。
涂板后3-4天长出来比较少见，但也正常。
涂板时要涂到都被培养基吸收才行，所以出现一小片白的也是正常的。
重新做批感受态再转吧。...

好的，我再转吧。你能不能给我详细写一下你做感受态及电转化的操作的具体步骤？我真怕是操作的问题，谢谢了！
还有转化的参数是什么？谢谢
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10楼2012-09-18 12:45:15
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