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毕赤酵母电转化问题求助
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我的电转步骤如下，但不知道是否有问题，涂到MD板上两天了，也没有长出来，请各位大侠帮我看看，谢谢 1. 感受态的制备：过夜培养的OD =1.4，取25ml离心---用25ml冰浴灭菌水重悬离心---用12.5ml冰浴灭菌水重悬离心----用2ml冰浴1M山梨醇重悬离心-------用500微升1M山梨醇重悬80微升分装----负80备用 2.质粒线性化：测序正确的质粒用SacI每期峨眉线性化------DNA直接回收试剂盒回收------用BAP去磷酸化试剂盒去磷酸化-------跑胶回收，用25微升TE洗脱，浓度大约为30ng/ul 3.电转化：用伯乐的电转移，按照仪器自身的毕赤酵母的电转参数进行，用的0.2的电转杯 4.电转后30℃静置1-2h，取200ul涂板；还有两个是把电转液1500g离心30s弃上清，沉淀混匀涂板 但两天了都没有东西长出来，不知道是不是哪儿出问题了，请指教 |
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 酵母表达纯化一站式解决！ | 【分子生物】EPI帖 |
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reallpf
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【答案】应助回帖
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475502411: 金币+10 2012-09-17 17:02:40
1949stone: 回帖置顶 2012-09-17 17:24:13
1949stone: MolEPI+1, 热情啊 2012-09-17 17:25:15
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1949stone: MolEPI+1, 热情啊 2012-09-17 17:25:15
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你的感受态等于是只用山梨醇处理了，这样效果不好。我在资源帖上分享了毕赤酵母现做现用感受态和长期保存感受态的制备方法。转化效率都非常好。建议你去看看然后试试。 你的菌OD值才1.4，只离心了25mL，菌量太少了，感受态不要做的菌量太低。 另外，质粒线性化后不用去磷酸化，都是线性化产物直接转毕赤酵母的。 电转后要加500--1000uL的冰预冷1 M山梨醇后再复苏，如果涂MD板是不用复苏的，涂抗性板需要摇床复苏1 h后再涂板。 涂板200uL太少了点，本来菌少转化效率也低，就要多涂。 仅为交流。 |
7楼2012-09-17 16:18:14
小丹木木
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reallpf
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个人觉得你的步骤没有什么变化。由于酵母的细胞壁是很厚的，感受态的制备过程中只有山梨醇处理没有什么效果。建议你用http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=4760057长期感受态制备方法。另外电转的参数都是一样的，任何一篇关于毕赤酵母学位论文都有。 |
47550241115楼2012-09-18 21:42:56
2楼2012-09-15 20:44:10
3楼2012-09-16 09:52:06
4楼2012-09-16 22:51:59
5楼2012-09-17 09:09:49
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谢谢，我初做看大家是这么说的 我请问一下，我用的是GS115，PIC3.5K，SacI线性化的，但不知道是否有问题，涂到MD板上3-4天了，长得跟针尖一样很小很小，不用力看都看不见，并且没有涂开的部分是一片一片的，连单个小菌落也没有，我都怀疑是不是克隆子，但应该是酵母，因为是酵母的味道。 涂板的时候取200ul涂板；还有两个是把转化后的全部菌1500g离心30s弃上清，沉淀混匀涂板 现在实在没有办法往下进展，因为我重复一次还是这样的，今天我把长出来的那些东西用YPD培养基冲洗下来分别涂了不同浓度的G418的YPD板和空白的YPD板，以及MD板，想看看能不能长出来 希望您能给我分析一下，往下怎么做？ 谢谢 |
8楼2012-09-17 17:00:34
reallpf
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