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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 毕赤酵母电转化问题求助
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475502411

铜虫 (著名写手)

[求助] 毕赤酵母电转化问题求助

我的电转步骤如下，但不知道是否有问题，涂到MD板上两天了，也没有长出来，请各位大侠帮我看看，谢谢
1. 感受态的制备：过夜培养的OD =1.4，取25ml离心---用25ml冰浴灭菌水重悬离心---用12.5ml冰浴灭菌水重悬离心----用2ml冰浴1M山梨醇重悬离心-------用500微升1M山梨醇重悬80微升分装----负80备用
2.质粒线性化：测序正确的质粒用SacI每期峨眉线性化------DNA直接回收试剂盒回收------用BAP去磷酸化试剂盒去磷酸化-------跑胶回收，用25微升TE洗脱，浓度大约为30ng/ul
3.电转化：用伯乐的电转移，按照仪器自身的毕赤酵母的电转参数进行，用的0.2的电转杯
4.电转后30℃静置1-2h，取200ul涂板；还有两个是把电转液1500g离心30s弃上清，沉淀混匀涂板

但两天了都没有东西长出来，不知道是不是哪儿出问题了，请指教
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1楼 2012-09-15 10:39:27
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
475502411: 金币+10 2012-09-17 17:02:40
1949stone: 回帖置顶 2012-09-17 17:24:13
1949stone: MolEPI+1, 热情啊 2012-09-17 17:25:15
你的感受态等于是只用山梨醇处理了，这样效果不好。我在资源帖上分享了毕赤酵母现做现用感受态和长期保存感受态的制备方法。转化效率都非常好。建议你去看看然后试试。

你的菌OD值才1.4，只离心了25mL，菌量太少了，感受态不要做的菌量太低。

另外，质粒线性化后不用去磷酸化，都是线性化产物直接转毕赤酵母的。

电转后要加500--1000uL的冰预冷1 M山梨醇后再复苏，如果涂MD板是不用复苏的，涂抗性板需要摇床复苏1 h后再涂板。

涂板200uL太少了点，本来菌少转化效率也低，就要多涂。

仅为交流。
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7楼2012-09-17 16:18:14
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reallpf

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 475502411 at 2012-09-17 17:00:34
谢谢，我初做看大家是这么说的
我请问一下，我用的是GS115，PIC3.5K，SacI线性化的，但不知道是否有问题，涂到MD板上3-4天了，长得跟针尖一样很小很小，不用力看都看不见，并且没有涂开的部分是一片一片的，连单个 ...

线性化完了先跑电泳检测下是否线性化完全和大小是否正确。
涂板后3-4天长出来比较少见，但也正常。
涂板时要涂到都被培养基吸收才行，所以出现一小片白的也是正常的。
重新做批感受态再转吧。
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9楼2012-09-18 09:22:21
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reallpf

木虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 475502411 at 2012-09-18 12:45:15
好的，我再转吧。你能不能给我详细写一下你做感受态及电转化的操作的具体步骤？我真怕是操作的问题，谢谢了！
还有转化的参数是什么？谢谢...

我在资源帖中发过感受态制备过程和转化。过程没有那么严格，步骤也都也的比较清楚。现做现用的要求要严格些。长期保存的主要是BEDS和DTT处理，没有什么特殊之处。我这说要写好多，你下载看看吧，更简单。
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12楼2012-09-18 13:27:19
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reallpf

木虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 475502411 at 2012-09-18 14:27:48
谢谢，好的，这是我的操作步骤，你看有问题吗？
感受态的制备：过夜培养的OD =1.4，取100ml离心---用25ml冰浴灭菌水重悬离心---用12.5ml冰浴灭菌水重悬离心----用2ml冰浴1M山梨醇重悬离心-------用300微升1M山梨醇 ...

个人觉得你的步骤没有什么变化。由于酵母的细胞壁是很厚的，感受态的制备过程中只有山梨醇处理没有什么效果。建议你用http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=4760057长期感受态制备方法。另外电转的参数都是一样的，任何一篇关于毕赤酵母学位论文都有。
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475502411 475502411
15楼2012-09-18 21:42:56
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reallpf

木虫 (正式写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 475502411 at 2012-09-19 10:12:47
您好，我还想问一下我要是现做感受态立即用，是不是可以用山梨醇的方法，因为我看了您给我发的那个连接，好几个试剂我们实验室都是没有的，买的话我问了要等到下周，我想这周做一次？
还有，线性化完不用去磷酸化 ...

现做现用的感受态方法http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=4734449。如果着急做可以用你自己的方法，转化量加大点看有没有结果。
线性化完不用去磷酸化，直接cycle-pure回收（DNA片段直接回收试剂盒），胶回收损失太大。如果没有cycle-pure试剂盒，必须用胶回收，就切的质粒多一点（5-10ug），但要酶切完全（电泳检测），胶回收做的好，回收率可以达到70%左右。
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475502411
18楼2012-09-20 10:13:25
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