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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 毕赤酵母电转化问题求助
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475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by xiaodao1 at 2012-09-16 22:51:59
我线性化后一般直接做了胶回收，用尽量少的无菌水洗脱，让质粒尽量弄。另外加山梨醇重悬的时候，没有具体的量，一般100mL的菌液做的感受态细胞，最后我是加200-400uL重悬，而且根据具体情况，尽量少加，让感受态细 ...

我想重新做感受态重新转化，想问一下你的电转参数是怎么样的？
我用的是GS115
载体是PIC3.5K和PIC9K
谢谢
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11楼2012-09-18 12:52:33
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reallpf

木虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 475502411 at 2012-09-18 12:45:15
好的，我再转吧。你能不能给我详细写一下你做感受态及电转化的操作的具体步骤？我真怕是操作的问题，谢谢了！
还有转化的参数是什么？谢谢...

我在资源帖中发过感受态制备过程和转化。过程没有那么严格，步骤也都也的比较清楚。现做现用的要求要严格些。长期保存的主要是BEDS和DTT处理，没有什么特殊之处。我这说要写好多，你下载看看吧，更简单。
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12楼2012-09-18 13:27:19
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475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by reallpf at 2012-09-18 13:27:19
我在资源帖中发过感受态制备过程和转化。过程没有那么严格，步骤也都也的比较清楚。现做现用的要求要严格些。长期保存的主要是BEDS和DTT处理，没有什么特殊之处。我这说要写好多，你下载看看吧，更简单。...

谢谢，好的，这是我的操作步骤，你看有问题吗？
感受态的制备：过夜培养的OD =1.4，取100ml离心---用25ml冰浴灭菌水重悬离心---用12.5ml冰浴灭菌水重悬离心----用2ml冰浴1M山梨醇重悬离心-------用300微升1M山梨醇重悬80微升分装

这是我听了朋友们的建议改了一下，准备后天做
你帮我看看还有问题吗？

谢谢
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13楼2012-09-18 14:27:48
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475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 475502411 at 2012-09-18 14:27:48
谢谢，好的，这是我的操作步骤，你看有问题吗？
感受态的制备：过夜培养的OD =1.4，取100ml离心---用25ml冰浴灭菌水重悬离心---用12.5ml冰浴灭菌水重悬离心----用2ml冰浴1M山梨醇重悬离心-------用300微升1M山梨醇 ...

还有，可不可以给我说下点转的参数，我用的是GS115
载体是PIC3.5K和PIC9K
谢谢
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14楼2012-09-18 14:33:18
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reallpf

木虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 475502411 at 2012-09-18 14:27:48
谢谢，好的，这是我的操作步骤，你看有问题吗？
感受态的制备：过夜培养的OD =1.4，取100ml离心---用25ml冰浴灭菌水重悬离心---用12.5ml冰浴灭菌水重悬离心----用2ml冰浴1M山梨醇重悬离心-------用300微升1M山梨醇 ...

个人觉得你的步骤没有什么变化。由于酵母的细胞壁是很厚的，感受态的制备过程中只有山梨醇处理没有什么效果。建议你用http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=4760057长期感受态制备方法。另外电转的参数都是一样的，任何一篇关于毕赤酵母学位论文都有。
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475502411 475502411
15楼2012-09-18 21:42:56
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475502411

铜虫 (著名写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
15楼: Originally posted by reallpf at 2012-09-18 21:42:56
个人觉得你的步骤没有什么变化。由于酵母的细胞壁是很厚的，感受态的制备过程中只有山梨醇处理没有什么效果。建议你用http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=4760057长期感受态制备方法。另外电转的参数都是一样 ...

谢谢，我知道了，有问题再请教您
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16楼2012-09-19 09:14:14
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475502411

铜虫 (著名写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
15楼: Originally posted by reallpf at 2012-09-18 21:42:56
个人觉得你的步骤没有什么变化。由于酵母的细胞壁是很厚的，感受态的制备过程中只有山梨醇处理没有什么效果。建议你用http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=4760057长期感受态制备方法。另外电转的参数都是一样 ...

您好，我还想问一下我要是现做感受态立即用，是不是可以用山梨醇的方法，因为我看了您给我发的那个连接，好几个试剂我们实验室都是没有的，买的话我问了要等到下周，我想这周做一次？
还有，线性化完不用去磷酸化直接跑胶回收吗？浓度会不会不够？
谢谢
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17楼2012-09-19 10:12:47
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reallpf

木虫 (正式写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 475502411 at 2012-09-19 10:12:47
您好，我还想问一下我要是现做感受态立即用，是不是可以用山梨醇的方法，因为我看了您给我发的那个连接，好几个试剂我们实验室都是没有的，买的话我问了要等到下周，我想这周做一次？
还有，线性化完不用去磷酸化 ...

现做现用的感受态方法http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=4734449。如果着急做可以用你自己的方法，转化量加大点看有没有结果。
线性化完不用去磷酸化，直接cycle-pure回收（DNA片段直接回收试剂盒），胶回收损失太大。如果没有cycle-pure试剂盒，必须用胶回收，就切的质粒多一点（5-10ug），但要酶切完全（电泳检测），胶回收做的好，回收率可以达到70%左右。
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475502411
18楼2012-09-20 10:13:25
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foxcl

铁虫 (正式写手)
1、OD600没有问题，初始在1.2-1.6都可以。剩下的做感受态也没啥问题。
　　不过最好现用现配。-80保存也是可以的。
２、线性化→ＤＮＡ清洁试剂盒回收（最后一步用６５度纯水洗脱，要是用ＴＥ的话，电转体系中盐离子浓度高，电击杯会爆火花的）
３、电转化你用什么参数？我们用1500v，25uF，200欧姆
4、转化完要加500－700山梨醇复苏，吸到EP管中30度复苏2－3h。然后涂MD板或G418板。
5、延长培养时间。我们的就是将近3天才长出来。

祝好。
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475502411
19楼2012-09-20 14:22:16
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475502411

铜虫 (著名写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
19楼: Originally posted by foxcl at 2012-09-20 14:22:16
1、OD600没有问题，初始在1.2-1.6都可以。剩下的做感受态也没啥问题。
　　不过最好现用现配。-80保存也是可以的。
２、线性化→ＤＮＡ清洁试剂盒回收（最后一步用６５度纯水洗脱，要是用ＴＥ的话，电转体系中盐离 ...

非常感谢
但是我昨天做的线性化，没有有加热的水洗脱，不过切了12微克的质粒，用25微升水洗脱的
我按你给我说的做一遍，转化后直接涂G418板，因为在MD板上长得好多，好小
希望能做出来
谢谢
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20楼2012-09-21 14:46:45
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